Molekulargenetische Untersuchung von Verlaufskontrollbiopsien beim Barrett-Ösophagus : Einfluss einer nicht standardisierten Probenentnahme auf die molekulare Analytik

Abstract

Der Barrett-Ösophagus ist eine Veränderung des distalen Ösophagus, bei dem durch chronischen säure- und gallehaltigen Reflux aus dem Magen eine intestinale Metaplasie entsteht. Der Barrett-Ösophagus tritt vor allem bei männlichen Kaukasiern auf. Eigentlich ohne wesentliche klinische Relevanz, wird der Barrett-Ösophagus durch seine maligne Potenz überhaupt erst interessant. Patienten mit dieser Veränderung haben ein ca. 30- bis 125-fach erhöhtes Risiko, ein Adenokarzinom des Ösophagus zu entwickeln. Die Entwicklung der Metaplasie zu einem Adenokarzinom erfolgt in einem mehrstufigen Prozess. Zunächst treten niedriggradige Dysplasien, gefolgt von höhergradigen Dysplasien auf. Um Patienten mit einem Adenokarzinom rechtzeitig einer kurativen Therapie zu unterziehen, müssen diese prämalignen Läsionen in endoskopischen Überwachungsprogrammen beobachtet werden. Ein Streitpunkt in der aktuellen Literatur ist der zeitliche Rahmen dieser Kontrolluntersuchungen und auch die Frage, welche Patienten eine erhöhte Wahrscheinlichkeit haben, ein Karzinom zu entwickeln. In vielen bisher veröffentlichten Arbeiten wurden nun verschiedenste so genannte Biomarker untersucht, die eine mögliche maligne Transformation der Barrett-Mucosa vorhersagen können. Bisher konnte sich noch keiner dieser Biomarker klinisch etablieren. Ziel unserer Studie war es genetische Veränderungen der für die Karzinogenese des Barrettkarzinoms relevanten Tumorsuppressorgene zu analysieren. Besonderes Augenmerk legten wir auf den zeitlichen Verlauf der genetischen Veränderungen im Rahmen der Kontrollendoskopien bei Patienten mit Barrett-Ösophagus. Hierzu griffen wir auf die in einem Zeitraum von bis zu 51 Monaten angefallen Präparate aus dem Archiv von PD Dr. Alles (Gießen) und dem Pathologischen Institut des Klinikum Kassel zurück. Insgesamt untersuchten wir 110 Proben von 26 Patienten. Die Zellen wurden mittels Laser-Mikrodissektion aus dem Gewebe gewonnen und nach einer PEP-PCR mit nachfolgender spezifischer Mikrosatelliten-PCR mittels einer Gelelektrophorese ausgewertet.Untersucht wurden die Mikrosatellitenmarker der Tumorsuppressorgene p53, p16, APC, DCC, DPC4 und Rb. Mögliche Ereignisse waren entweder ein Verlust der Heterozygotie (LOH), eine Mikrosatelliteninstabilität oder eine homozygote Deletion.Als Ergebnis unserer Studie war ein Anstieg der LOH-Kombinationen von APC und p53 sowie APC und p16 relativ früh in der neoplastischen Entwicklung des Barrettkarzinoms zu erkennen. Statistisch war dieser Anstieg ein Trend ohne Signifikanz.Als wichtigste Erkenntnis zeigt sich, dass vermutlich in bereits sehr vielen Studien ein mangelhaftes Untersuchungsprotokoll zu verfälschten Ergebnissen geführt hat. Hierdurch ließen sich die teilweise sehr divergierenden Ergebnisse mancher Studien erklären. In dem uns vorliegenden Material fanden wir in Verlaufsbiopsien nur in etwas weniger als der Hälfte der entnommenen Biopsien Barrett-Mucosa. Auch ältere Studien zeigen, dass das bisher benutzte Untersuchungsprotokoll nicht ausreicht, um die teilweise sehr kleinen high-grade-IEN oder Adenokarzinome in der Barrett-Mucosa zu entdecken.Auch wir empfehlen, zukünftig die Probenentnahme im Rahmen der Barrett-Kontrollendoskopien als eine Quadrantenbiopsie mit einem 1 cm-Intervall mit so genannten Jumbo -Forceps in der turn-and-suction -Technik durchzuführen. Zusätzlich sollten alle makroskopisch auffälligen Areale großzügig mitbiopsiert werden. Von anderen Autoren wird dieses Vorgehen als das Seattle-Protokoll bezeichnet.Nur auf diese Weise können zukünftige molekulargenetische oder histomorphologische Untersuchungen eine entsprechende Aussagekraft gewährleisten. Barrett s mucosa is a preneoplastic condition predisposing to Oesophageal adenocarcinoma. The prevalence of Barrett s mucosa is estimated to be 1 in 50-200 people. The risk of progression to oesophageal cancer is estimated to be 30-125 fold and progression is most likely to be a multistep process. Until today dysplasia (intraepithelial neoplasia, IEN) is thought to be the best biomarker available for risk of progression to adenocarcinoma in patients with Barrett s metaplasia. However, important pitfalls especially in the recognition of low grade IEN are high interobserver variability and the difficulties of diagnosis of IEN in the background of severe inflammation. The development of IEN can be recognized by endoscopic biopsy which is recommended as surveillance for all surgically fit Barrett s mucosa patients. However, this is neither feasible nor cost effective. Thus, for optimized surveillance it is necessary to 1.) identifiy patients with increased risk of progression, e.g. by use of predictive biomarkers which may more accurately predict the subgroups progressing to malignant disease, and 2.) determining an interval of endoscopic surveillance being effective in regard of cost and early surgical intervention, e.g. by mucosectomy.In this study we performed molecular genetic analyses of laser microdissected biopsy specimens taken from surveillance biopsies after the diagnosis of Barrett s mucosa without high grade IEN in a follow-up time up to 51 months. The prospective data presented here highlight the need for accurate and extensive sampling as a prerequisite for reliable molecular genetic analyses.Formalin fixed paraffin embedded biopsy specimens from 26 Patients obtained at surveillance endoscopy after a diagnosis of Barrett s oesophagus were laser microdissected (18 men and 8 women, age between 45 and 82 years, samples from the Institute of Pathology Klinikum Kassel and Department of Pathology Evangelisches Krankenhaus Giessen collected between 1996 and 2002). Only specimens with Barrett s metaplasia or low grade IEN were chosen for initial molecular genetic analyses after the diagnosis has been confirmed by at least two expert pathologists. Follow up biopsies were available for an interval between 6 and 51 months. Biopsy samples or tissue specimens with normal gastric mucosa or normal squamous epithelium from the oesophagus served as normal controls. Suitable DNA could be obtained from 110 biopsy samples consisting of 91 samples with metaplastic Barrett s epithelium and 17 samples with low grade IEN. Two samples were from two patients who progressed to Barrett s adenocarcinoma during the surveillance interval. Samples taken during surveillance endoscopy that did not contain Barrett s mucosa were excluded from the study or served as normal controls. In addition, samples from the distal oesophagus in which the presence of metaplastic gastric mucosa could not be ruled out were also excluded from the study.Our data show that there is no significant increase of LOH events at least in a 51 months interval. In two patients, Barrett s adenocarcinoma was diagnosed 6 months after first diagnosis of Barrett s mucosa. 6 of 26 patients did not show LOH. The remaining patients exhibited a striking variation of LOH pattern and accumulation in individual biopsy samples taken over time. From our microsatellite marker panel we were not able to define a surrogate marker which could serve as a potential biomarker or biomarker set indicating an increased risk for progression to Barrett s adenocarcinoma.As a result and consequence of our sampling data of biopsy specimens, the performance of multiple (quadrant) biopsies in an interval of 10 mm in a Barrett s mucosa segment, if possible, with a jumbo forceps is strongly suggested. This sampling technique is a prerequisite for reliable molecular analysis of the biopsy specimens to answer important questions in regard of biological dynamics of epithelial cell clones in addition to the search for future biomarkers predictive for neoplastic progression. In addition, a side effect of accurate sampling with important benefit to the patient will be early detection of small dysplastic areas or even small adenocarcinomas which may be otherwise missed.