Detection of NADPH oxidase subunits NOX1 and NOX4 in lung adenocarcinoma A549 cells, and impact of NOX1 on Nrf2- and HIF-1-dependent gene regulation

Abstract

NADPH oxidase 1 and 4 are ROS generating enzyme complexes that play an importantrole in cellular signaling. The core subunits of NADPH oxidase 1 and 4 are NOX1 andNOX4, respectively.The immuno-detection of NOX1 and NOX4 proteins is a commonly faced problem.Protein bands of different molecular weights suggested to represent NOX1 and NOX4have been described in previous studies. These bands could represent, for example,different NOX splice variants, posttranslational modifications, proteolytic products ornon-specifically immunoreacting proteins. Thus, well validated NOX1 and NOX4antibodies are critical for further functional and structural characterization of theseproteins. Based on this, the aims of the first part of the work were: 1. To test and to selectmost suitable antibodies for the detection of NOX1 and NOX4 in human adenocarcinomaA549, CaCo2 cells and HUVEC, 2. To determine the subcellular localization of NOX1and NOX4, 3. To identify putative NOX1 and NOX4 proteins by mass spectroscopic(MS) analysis.Employing several commercially available and custom made NOX1 and NOX4antibodies it was obvious that neither of the antibodies detected any common band.Further, by employing specific siRNAs, custom made antibodies termed NOX1wch andNOX4jh were identified as suitable for NOX1 and NOX4 detection. Using theseantibodies we also determined the presence of NOX1 and NOX4 in certain subcellularfractions. The results showed that both NOX1 and NOX4 were predominantly localizedin the cytoskeleton fraction of A549 cells. This observation was partially in contrast toprevious studies demonstrating the presence of endogenous NOX1 in the membranefraction of different cell types including those that we used.In addition to proteins of the predicted size, the NOX1wch and NOX4jh antibodies alsodetected other protein species of lower or higher molecular weight. To identify theseadditional bands and to confirm the identity of NOX1 and NOX4 full length proteins,purification and MALDI-TOF MS analysis was performed. However, neither of theanalysed proteins were identified as NOX-related which does not mean that this is not thecase. This might be explained, for example, by low abundance of NOX1 and NOX4proteins, or by technical limits of the protein purification and identification procedure.Furthermore, we determined that NOX1 predominates in ROS generation in comparisonto NOX4 in A549 cells which was in accordance with a higher expression level of NOX1mRNA than NOX4 mRNA in A549 cells.In conclusion, this part of the work identified NOX1 and NOX4 antibodies that aresuitable for the detection of NOX1 and NOX4 by Western blot. These antibodies wereemployed for the detection of NOX1 and NOX4 proteins in certain biochemical fractionsrepresenting different subcellular compartments. Furthermore, the open attempt for thepurification and identification of NOX1 and NOX4 proteins was performed, and theseresults may be considered as the basis for further proteomic experiments.NADPH oxidase 1 is a significant source of ROS in A549 cells. ROS are involved in theregulation of the transcription factors HIF-1 and Nrf2. Trx1 represents a target gene ofNrf2 that is known to induce HIF-1a. Intermittent hypoxia occurs in differentpathophysiological conditions and is characterized by fluctuations of oxygen and ROSlevels with impact on both HIF-1 and Nrf2.In this context, the aims of this part of the study were: 1. To analyse the expression ofNOX1, HIF-1a, Nrf2 and Trx1 under different conditions of oxygenation in A549 cells,2. To analyse possible cross-talk(s) between these components, particularly underconditions of intermittent hypoxia.Initial experiments revealed, that whereas HIF-1a was up-regulated both in continuousand intermittent hypoxias, the Nrf2, Trx1 and NOX1 as well as NOX1-derived ROS wereonly up-regulated in intermittent hypoxia. NOX1 was determined as crucial for enhancedROS production in intermittent hypoxia that in turn mediated induction of Nrf2 and Trx1.The regulation of Nrf2 and Trx1 by NOX1 was confirmed by both inhibition ofendogenous NOX1 and overexpression of recombinant NOX1 protein. Employing aproteosomal inhibitor, NOX1 was demonstrated to activate Nrf2 at the level of proteinstability. Subsequently, Nrf2-dependent Trx1 induction turned out to enhance HIF-1asignaling in intermittent hypoxia.In sum, we identified a signal transduction pathway that causes the enhancement of HIF-1a mediated by NOX1, Nrf2 and Trx1 in response to intermittent hypoxia. NADPH Oxidase 1 und 4 sind ROS generierende Enzymkomplexe mit einer wichtigenFunktion in der Signaltransduktion. Die wesentlichen Untereinheiten sind NOX1 undNOX4.Die Immunodetektion von NOX1 und NOX4 ist problematisch. Proteinbanden mitverschiedenem Molekulargewicht wurden beschrieben. Diese Banden könntenverschiedene Splicevarianten, posttranslationale Modifikationen, proteolytischeSpaltprodukte oder unspezifische Proteine darstellen. Daher sind gut validierte NOX1und NOX4 Antikörper wesentlich für weitere funktionelle und strukturelleUntersuchungen von NOX1 und NOX4. Darauf basierend waren die Ziele des erstenTeils der Arbeit 1. Verschiedene Antikörper für NOX1 und NOX4 zu testen undmöglichst geeignete Antikörper für den Nachweis von NOX1 und NOX4 in humanenAdenokarzinom- und HUVEC Zellen auszuwählen, 2. Die subzelluläre Lokalisation vonNOX1 und NOX4 zu identifizieren, 3. Mögliche NOX1 und NOX4 Proteine durchMassenspektroskopie zu identifizierenUnter Einsatz verschiedener kommerziell erhältlicher und custom made NOX1 undNOX4 Antikörper war es offensichtlich, dass mit keiner der verwendeten Antikörperübereinstimmende Banden detektiert wurden. Basierend auf der spezifischen Inhibitionvon NOX1 und NOX4 mit siRNA wurde ein NOX1 Antikörper (NOX1wch) und einNOX4 Antikörper (NOX4jh) als geeignet für den Nachweis von NOX1 und NOX4identifiziert. Mit diesen Antikörpern wurden NOX1 und NOX4 in verschiedenensubzellulären Fraktionen detektiert und analysiert. Dabei zeigte sich, dass sowohl NOX1als auch NOX4 vorwiegend in Fraktionen des Zytoskeletts enthalten war. DieseBeobachtung steht teilweise im Kontrast zu Studien, die das Vorhandensein von NOX1und NOX4 in den Membranfraktionen verschiedener Zelltypen (die von uns benutzteneingeschlossen) fanden.Außerdem wurden mit den Antikörpern NOX1wch und NOX4jh andere Proteinspeziesmit abweichenden Molekulargewichten detektiert. Diese Proteine und die mit erwartetemMolekulargewicht wurden nach verschiedenen Aufreinigungsschritten mit MALDI-TOFMS analysiert. Jedoch konnte keiner dieser Proteinbanden als NOX Protein identifiziertwerden, was jedoch nicht heißt, dass es sich nicht um NOX Proteine handelt. Dies kanndurch das geringe Vorkommen von NOX1 und NOX4 oder durch die Grenzen derverwendeten Proteinaufreinigung und Identifizierung bedingt sein.Außerdem wurde in der Studie aufgezeigt, dass NOX1 im Vergleich zu NOX4 diewesentliche ROS Quelle in A549 Zellen darstellt, was im Einklang mit den erhöhtenmRNA Spiegeln von NOX1 im Vergleich zu NOX4 ist.Zusammenfassend wurden in diesem Teil der Arbeit Antikörper gegen NOX1 und NOX4identifiziert, die geeignet sind für den Nachweis von NOX1 und NOX4 im Western Blot.Diese Antikörper wurden dazu genutzt, um NOX1 und NOX4 Proteine in biochemischenFraktionen, die verschiedene subzelluläre Kompartimente repräsentieren nachzuweisen.Außerdem wurde der noch offene Versuch der Aufreinigung und Identifizierung vonNOX1 und NOX4 Proteinen durchgeführt, dessen Ergebnisse, die Grundlage fürweitergehende Experimente in diese Richtung darstellen.NADPH Oxidase 1 ist eine signifikante Quelle von ROS in A549 Zellen. ROS sind ander Regulation der Transkriptionsfaktoren HIF-1 und Nrf2 beteiligt. Trx1 repräsentiertein Zielgen von Nrf2, das bekanntermaßen HIF-1a induziert. Der zyklische Wechsel vonNormoxie und Hypoxie (intermittent hypoxia) kommt unter verschiedenenpathophysiologischen Bedingungen vor und ist durch Fluktuationen der Sauerstoff undROS Spiegel mit Einfluss auf HIF-1 und Nrf2 gekennzeichnet. In diesem Zusammenhangwaren die Ziele dieses Teils der Arbeit: 1. Die Expression von NOX1, HIF-1a, Nrf2 andTrx1 unter verschiedenen Oxygenierungsbedingungen in A549 Zellen zu analysieren, 2.Eine mögliche Interaktion dieser Komponenten insbesondere in intermittent hypoxia zuuntersuchen. Es zeigte sich, dass HIF-1a sowohl nach andauernder Hypoxie als auchnach intermittent hypoxia hoch reguliert war während Nrf2, Trx1, NOX1 und NOX1-abgeleitete ROS nur nach intermittent hypoxia hoch reguliert waren. NOX1 erwies sichdabei als entscheidend für die erhöhte ROS Generierung in intermittent hypoxia, dienachfolgend für die Induktion von Nrf2 und Trx1 relevant war. Die Regulation von Nrf2und NOX1 wurde bestätigt durch die Inhibition von endogenem NOX1 und dieÜberexpression von rekombinantem NOX1. Durch Verwendung eines ProteasomInhibitors konnte gezeigt werden, dass NOX1 Nrf2 auf der Ebene der Proteinstabilitätinduziert. Nachfolgend, verstärkt die Nrf2-abhängige Induktion von Trx1 die HIF-1a Antwort in intermittent hypoxia.Zusammenfassend wurde ein Signaltransduktionsweg aufgezeigt, der die HIF-1aAntwort in NOX1-, Nrf2- und Trx1-abhängiger Weise unter Bedingungen vonintermittent hypoxia verstärkt.