Methodenoptimierung für den automatisierten "On-Membrane-Digest" nach Western Blot

Abstract

Ein wichtiger Bestandteil der Proteomik ist die Identifizierung exprimierter Proteine und dieAnalyse der Proteome von Zellen, Organellen und ganzen Organismen. Diese Methodenwerden z.B. bei der Untersuchung von Krankheitserregern oder pathologischenVeränderungen in der medizinischen Forschung eingesetzt.Die 2D-Gelelektrophorese mit anschließendem In-Gel-Verdau in Kombination mit derMassenspektrometrie stellt neben LC-basierenden Methoden eine der bisher bestenMöglichkeiten dar, Proteine zuverlässig zu identifizieren.In dieser Arbeit wurde eine automatisierte Methode entwickelt, nach der 2DGelelektrophoreseund dem Transfer der Proteine auf NC- bzw. PVDF-Membranen denproteolytischen Verdau auf der Blot-Membran zu ermöglichen.Zur Detektion der Proteine auf den Membranen wurden diese mit dem Farbstoff Direct Blue71 angefärbt. Anschließend konnten die Spots aus den Membranen ausgeschnitten und demautomatisierten Verdau zugeführt werden. Ein Großteil dieser Arbeit bestand darin, denautomatischen On-Membrane-Verdau hinsichtlich der nachfolgendenmassenspektrometrischen Identifizierung der Proteine durch Peptide-Mass-Fingerprint-Analysen zu optimieren, indem Parameter wie Verdauzeit, Zusammensetzung derExtraktionslösung, Zugabe von Octylglycosid zu den Verdaupuffern und Trypsinmengevariiert wurden.Diese Methode wurde dann für die Analyse von Proteinen nach vorangegangenem WesternBlot und Immunodetektion per ECL weiterentwickelt. Hier war die Entwicklung einereffizienten Waschmethode zur Entfernung des Blockierungsreagenzes Roti-Block vonentscheidender Bedeutung.Nach dem automatischen Verdau wurden die Verdauextrakte nach geeigneterMatrixpräparation auf einen MS-Probenträger aufgetragen und der MS-Analyse zugeführt. Indiesem Teil der Arbeit wurden die Proteinidentifizierungen mittels dreier verschiedenerMatrices verglichen: HCCA-Matrix nach Jahn, DHB/HCCA-Mischmatrix und DHB/H3PO4-Matrix. Hierbei stellte sich heraus, daß Matrices unterschiedlich stark auf Kontaminationenaus dem Western-Blot Prozess reagieren. So stört das Blockierungsreagenz Roti-Block dieMessung mit HCCA-haltigen Matrices erheblich.Die Entwicklung dieser automatisierten Verdaumethode direkt von Western Blot-Membranenermöglicht nun mit minimiertem manuellem Aufwand die Identifizierung von Proteinen auskomplexen Proteinproben heraus direkt von Western Blot-Membranen nach immunologischerDetektion und wird zukünftig derartige Analysen deutlich erleichtern. An important part of proteomics is the identification of expressed proteins and the analysis ofproteomes of cells, organelles or whole organisms. These methods are used in medicalresearch e.g. for the investigation of pathogens or pathologic changes.The 2D-gel-electrophoresis combined with in-gel digest and mass spectrometry is apartfrom LC-based methods so far one of the best strategies to identify proteins reliably.In this thesis, an automated method for the proteolytic digest on the blotting membranes after2D-gel-electrophoresis and blottingof the proteins onto NC- or PVDF-membranes wasdeveloped.For the detection of proteins on the membranes, a Direct Blue 71 staining was performed.Afterwards, spots were picked from the membranes and subjected to the automated digestion.A major part of this work focused on the optimization of the automated on-membrane-digestin order to get optimal results in the following mass spectrometric protein identification bypeptide-mass-fingerprint-analysis. Therefore, parameters like digestion time, composition ofthe extraction solution, addition of detergents like octylgycoside to the digestion buffer or theamount of trypsin were varied.Furthermore, this method adapted for the analysis of proteins after western blotting andimmunodetection via ECL. For this purpose, the development of an efficient washing methodto remove the blocking reagent Roti-Block was the critical point.After the automated digestion and the extracted peptides were applied onto the MS sampletray by apropriate matrix preparation and subjected to MS-analysis.In a further part of the thesis, three different matrices were compared regarding optimalprotein identification: the HCCA-matrix introduced by Jahn, a mixed matrix consisting ofDHB/HCCA und the DHB/H3PO4-matrix.It was observed that the matrices showed remarkably different sensitivities towardscontaminations of the samples with Roti-Block derived from the blocking process of thewestern blot process. The blocking reagent Roti-Block was found to impair the measurementwith HCCA-containing matrices tremendously.The automated digestion method directly from western blot membranes developed in thisthesis enables now the identification of proteins from complex protein samples directly fromwestern blot membranes after immunologic detection with a minimal manual intervention andwill, therefore, facilitate such analyses in the future significantly.