Peroxisomen in Zahngeweben

Abstract

Milde Formen peroxisomaler Krankheiten gehen mit Mikrognathie, Zahnfehlstellungen und Schmelzhypoplasien einher. Trotz dieser bekannten Zahndefekte wurden diese Zellorganellen und deren metabolische Funktion in Zahngeweben jedoch noch nicht untersucht. Peroxisomen im Zahngewebe wurden lediglich in der Literatur in einer ultrastrukturellen Studie in Odontoblasten kurz erwähnt, jedoch nicht näher charakterisiert.Mein Ziel war es daher herauszufinden, inwieweit diese Organellen in Zahngeweben vorkommen und welche Aufgaben sie dort erfüllen könnten. Zur Beschreibung peroxisomaler Veränderungen während der Zahnentwicklung wurden Mäuse verschiedener Entwicklungsstadien (E13,5-P3 und P90) mit Formaldehyd-Fixans perfusionsfixert und zur morphologischen Auswertung in Paraffin eingebettet. Weiterhin wurden Kopfpräparate von Knockoutmäusen mit einem peroxisomalen Biogenesedefekt (PEX11ß, P0.5) auf Veränderung der Zahnentwicklung untersucht. Außerdem wurden in verschiedenen Zahngeweben spezifische mRNAs peroxisomaler Proteine und zelltypspezifischer Antigene mittels RT-PCR an mikrodissektierten Material von Amelo- und Odontoblasten nachgewiesen. Nach Etablierung von optimalen methodischen Vorraussetzungen zur subzellulären Lokalisation von Organellen in Paraffinschnitten von Zahngewebe, konnten mithilfe von monospezifischen Antikörpern gegen verschiedene peroxisomale Markerproteine (Katalase, Acyl-CoA-Oxidase I, ABCD3 Lipid-Transporter, Biogeneseproteine: Pex13p und Pex14p) Peroxisomen in verschiedenen Zahngeweben durch indirekte Immunhistochemie mit ABC-Verfahren oder Immunfluoreszenz lokalisiert und deren heterogene Enzymzusammensetzung in spezifischen Zellen der Zahngewebe nachgewiesen werden. Weiterhin wurde das Vorkommen der entsprechenden mRNAs in Amelo- und Odontoblasten gezeigt. Die Ergebnisse erbrachten eindeutig, dass Peroxisomen in allen Zahngeweben in unterschiedlicher Anzahl und verschiedener Lokalisation vorkommen. Jedoch besonders in sekretorischen Amelo- und Odontoblasten ist dieses Zellkompartiment stark ausgeprägt. Im Gegensatz zu Mitochondrien sind in diesen Zellen die Peroxisomen besonders häufig in den jeweils fortsatznahen Arealen lokalisiert, was gemeinsam mit dem Vorhandensein deren metabolischer Enzyme auf eine spezifische Funktion dieser Organellen während der Sekretionsphase schließen lässt. Im Gegensatz zu Odontoblasten beinhalten Peroxisomen in Ameloblasten kaum Katalase-Protein, was zu einer stärkeren Empfindlichkeit der Ameloblasten gegenüber von reaktiven Sauerstoffspezies (z.B. H2O2) führen könnte. In PEX11ß-Knockout-Mäusen wurden eindeutige Entwicklungsveränderungen in der Ausprägung der Amelo- und Odontoblastenanordnung und deren Maturierung nachgewiesen. Das PEX11ß-Knockout-Maus-Modell scheint sich deshalb gut für zukünftige Studien zur Untersuchung der molekularen Pathogenese der Zahnmissbildungen bei peroxisomalen Krankheiten zu eignen. Patients with mild forms of peroxisomal disorders show facial dysmorphism, suffer from deformations in dentition and exhibit enamel hypoplasia. However, no information is available on peroxisomes in dental and paradental tissues. In the peer reviewed literature in one ultrastructural study peroxisomes were mentioned in odontoblasts however, without any closer characterization. To get some more insights on the functional role of peroxisomes in dental tissues, in this dissertation the distribution and enzyme composition of these organelles were described in different stages of tooth development (E13.5-P3) and knockout-mice with a peroxisomal biogenesis defect (PEX11ß, P0.5) in formaldehyde-fixed and paraffin embedded tissue samples. In addition, fresh unfixed heads were immediately frozen to be used for laser-assisted microdissection of ameloblasts and odontoblasts followed by RNA isolation and RT-PCR analysis for the expression of marker genes for peroxisomes and dental specific cell types. After establishment of the correct methodological conditions for subcellular organelle visualization by adaption of the immunohistochemical ABC-peroxidase method and the indirect immunofluoreszence technique to dental tissues, peroxisomes and their enzyme composition were analyzed in different cell types and tooth regions using monospecific antibodies for different marker proteins such as catalase, acyl-CoA-oxidase I, ABCD3-lipid-transporter, Pex13p and Pex14p. Furthermore we detected the corresponding mRNAs of the peroxisomal genes in ameloblasts and odontoblasts.The results of this thesis revealed the presence of peroxisomes in all dental tissues with different intracellular distribution and abundance between distinct cell types. A significant increase of the abundance and a redistribution of peroxisomes were noted during the course of maturation of ameloblasts and odontoblasts. In contrast to mitochondria, peroxisomes in differentiated ameloblasts were localized mainly in the vicinity of the Tomes process. During this maturation process a strong heterogeneity of peroxisomal enzyme content appeared within distinct cell types. A drastic down regulation of catalase in maturing ameloblasts was noted in comparison to odontoblasts. The importance of functional peroxisomal organelles for tooth development and maturation of ameloblasts and odontoblasts was demonstrated in PEX11ß-knockout-mice in which the dental tissues were clearly different to the wildtyp. The structural defects of ameloblast rows in teeth of PEX11ß-/- mice suggest that this animal model is suitable to study the development of the tooth deformities occurring in patients with peroxisomal disorders.