Nonvirale Transfektion von Fibroblasten bei rheumatoider Arthritis

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde versucht mittels nonviraler Transfektion von antisense-RNA produzierenden Plasmiden oder antisense-RNA-Sonden in die Proteinsynthese synovialer Fibroblasten von RA-Patienten in vitro einzugreifen, um so die Voraussetzung für einen späteren gentherapeutischen Ansatz zu schaffen. Hierzu wurden Plasmide entwickelt, die sense- oder antisense-RNA von IL-6 oder p33ING1 produzieren konnten. Anschließend wurde versucht, diese mittels unterschiedlicher Transfektionsreagenzien in synoviale Fibroblasten zu transfizieren. Da sich in den entsprechenden Nachweismethoden (IL-6 Elisa, cDNA-Array, LightCycler) keine signifikanten Änderungen der Proteinproduktion bzw. Genexpression nachweisen ließen, wurde auf eine Transfektion mit GFP-Plasmiden gewechselt, um die Transfektionsraten nachweisen und optimieren zu können. Hierbei konnten unter den günstigsten Bedingungen Transfektionsraten von ca 5-10% erreicht werden. Dies entspricht in etwa anderen publizierten Transfektionsraten von Fibroblasten (Jacobsen et al. 2006). Für den in vitro-Gebrauch ist aber die virale Transfektion die deutlich effizientere Methode zur Transfektion von synovialen Fibroblasten mit Transfektionsraten bis zu 90% bei adenoviraler Transfektion (Judex 2001). Zusammengefaßt ist die Transfektion von RA-Fibroblasten mit Zielgenen trotz ihrer Heterogenität möglich. Die verschiedenen Transfektionstechniken weisen aber hohe Unterschiede in ihrer Effizienz auf. In the present experimental approach, we tried to alter the protein synthesis of synovial fibroblasts from patients with rheumatoid arthritis (RA) by transfecting antisense-RNA-producing-plasmids and antisense-RNA by nonviral methods, in order to facilitate the development of gene therapeutic strategies in the future.Specifically, we developed plasmids that were able to code for IL-6- or p33ING1- sense- or antisense-RNA and transfected synovial fibroblast using different tansfection reagents.Because of the low yield reflected by an unchanged protein production/gene expression as measured with different detection methods (IL-6-ELISA, cDNA-Array, Lightcycler), we changed the transfection protocol by using GFP-Plasmids in order to optimize the rate of transfected cells.Herewith, after optimizing the transfection conditions, transfection rates up to 5-10% could be achieved, which is according to the results of other published transfection rates of fibroblasts. In addition, viral transfection revealed to be the most effective method in vitro for transfecting synovial fibroblasts with transfection rates up to 90% when using adenoviruses.In summary, effective transfection of RA synovial fibroblasts with different genes-of-interest is feasible, but the different transfection methods vary considerably with respect to their effectivity.