Extrazelluläres ATP schützt humane Endothelzellen vor Ischämie-induzierter Apoptose

Abstract

Die Zerstörung der endothelialen Integrität durch Ischämie-induzierte Apoptose ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung des Ischämie/ Reperfusionsschadens. Ziel dieser Arbeit war daher die Identifikation endogener Mechanismen endothelialer Zellen, die der Progression des apoptotischen Zell- untergangs während Ischämie entgegenwirken, um daraus neue therapeutische Konzepte abzuleiten. Im Mittelpunkt der Untersuchungen stand dabei die Frage, welchen Einfluss das während Ischämie/Reperfusion vermehrt freigesetzte Signalmolekül ATP auf die endotheliale Apoptose hat. Zur Beantwortung dieser Frage wurden kultivierte Endothelzellen einer zweistündigen Ischämie ausgesetzt, die eine Caspase 3-abhängige Apoptose auslöste. Zu Beginn der simulierten Ischämie fand sich ein kurzfristiger Anstieg der ATP-Freisetzung. Durch gezielten Einsatz der RNA-Interferenz konnte gezeigt werden, dass diese initiale ATP-Freisetzung ein Cx43-abhängiger Prozess ist. Während der gesteigerte Abbau des freigesetzten ATP durch Zugabe der löslichen Ekto-ATPase Apyrase einen Anstieg der Ischämie-induzierten Apoptose nach sich zog, bewirkte die Hemmung des endogenen ATP-Abbaus durch Einsatz des Ektonukleotidase-Inhibitors ARL 67156 eine signifikante Reduktion des apoptotischen Zelluntergangs. Dieser endogene anti-apoptotische Effekt konnte durch die exogene Zugabe von ATP während simulierter Ischämie verstärkt werden. Im Rahmen eines pharmakologischen Ansatzes zeigte der spezifische P2Y2-Agonist UTP eine dem ATP äquipotente Wirkung auf die Ischämie-induzierte Apoptose. Die Aktivierung der P2Y2-Rezeptoren durch ATP/UTP bewirkte eine simultane Phosphorylierung von ERK 1/2 sowie von Akt zu Beginn der Ischämie. Entsprechend führte die Blockade dieser Signalwege durch den spezifischen MEK-Inhibitor UO126 bzw. durch den PI3K-Inhibitor LY294002 zu einer Beseitigung der anti-apoptotischen Wirkung von ATP/UTP. Damit präsentiert die vorliegende Arbeit einen neuen anti-apoptotischen Mechanismus humaner Endothelzellen, der auf einer durch P2Y2-Rezeptoren vermittelten Aktivierung des MEK/ERK- und des PI3K/Akt-Signalwegs beruht. Die gezielte Aktivierung dieses protektiven Mechanismus könnte eine neue therapeutische Strategie in der Behandlung des Ischämie/Reperfusionschadens darstellen. The disruption of endothelial integrity by ischemia-induced apoptosis plays a crucial role in the development of ischemia/reperfusion injury. The present study aims to identify the endogenous mechanism by which endothelial cells counteract the progression of apoptotic cell death during ischemia. Although it was shown that the signaling molecule, ATP is released from cells of the cardiovascular system in response to acute ischemia, its effect on ischemia-induced apoptosis of endothelial cells is not yet clear. Here, it was hypothesized that extracellular ATP that is released from endothelial cells during ischemia activates an endogenous anti-apoptotic mechanism. To test this hypothesis, cultured human endothelial cells were exposed to two hours of simulated ischemia to induce a stable rate of caspase 3-dependant apoptosis. A transient increase of extracellular ATP was observed at the beginning of Ischemia. Use of specific siRNA revealed that this initial release of ATP is a Connexin43-dependant process. The enhanced degradation of extracellular ATP by addition of the soluble ecto-ATPase Apyrase during ischemia increased apoptotic cell death. In contrast, the inhibition of endogenous ATP-degradation by adding the ectonucleotidase-inhibitor ARL 67156 significantly reduced ischemia-induced apoptosis. This endogenous anti-apoptotic effect could be potentiated by exogenous addition of ATP during simulated ischemia. By using a pharmacological approach it was shown the addition of the specific P2Y2-agonist UTP during ischemia could mimic the protective effect of ATP. Activation of P2Y2-receptors by ATP/UTP during ischemia led to a significant increase in ERK1/2- and Akt-phosphorylation, Accordingly, the inhibition of MEK/ERK by UO126 and PI3K/Akt by LY294002 abolished the anti-apoptotic effect of ATP/UTP. Thus, the present study shows a new anti-apoptotic mechanism in human endothelial cells that occurs via a P2Y2-receptor mediated activation of MEK/ERK- and PI3K/Akt-signaling pathway. Targeted activation of this protective mechanism could represent a novel therapeutic strategy in the treatment of the ischemia/reperfusion injury.