Smad4 als endogener Repressor von Hypertrophie in adulten Kardiomyozyten der Ratte

Abstract

Hypertrophes Wachstum repräsentiert den Schutz des Herzens gegenüber einer erhöhten Druckbelastung. Das Fortschreiten einer Hypertrophie kann zur Dekompensation und Verschlechterung der Herzfunktion führen. Mehrere Studien zeigen, dass Smad-Proteine wesentlich am kardialen Remodelling beteiligt sein können. Ziel dieser Studie war es, die Bedeutung von Smad4 für die kardiale Hypertrophieentwicklung zu untersuchen.Um zu analysieren, inwieweit Smad4 eine Rolle in der kardialen Hypertrophie-Entwicklung spielt, wurde ein funktioneller Knock-Out von Smad4 in adulten Kardiomyozyten der Ratte mit Smad4-Antisense-Oligonukleotiden herbeigeführt. Die Transformation der Zellen mit Smad4-Antisense-Oligonukleotiden reduzierte die Smad4-Proteinexpression nach 28 Stunden auf 34,68 +- 7,07 % (n=4) und nach 48 Stunden auf 10,75 +- 2,69 % (n=3). Hy¬per¬trophieinduktion wurde nach 24 Stunden Inkubation mit Smad4-Antisense-Oligonukleotiden durch 14C-Phenylalanin-Einbau als Proteinsynthese gemessen. Im Vergleich zu Kontrollzellen stieg die Proteinsynthese bei Hemmung von Smad4 auf 133,87 +- 15,75 % (n=24; p<0,05). Adrenerge Stimulation mit Phenylephrine (PE) erhöhte die Proteinsyntheserate auf 152,37 +- 5,66 (n=22; p<0,001). Die gleichzeitige Transformation der Zellen mit Smad4-Antisense-Oligonukleotiden und Stimulation mit PE steigerte die Proteinsyntheserate auf 162,52 +- 9,72 % (n=24; p<0,001). Um zu überprüfen, welche Signalwege in der Smad4 regulierten Hypertrophie beteiligt sind, wurden verschiedene Kinase-Inhibito¬ren eingesetzt. Die Gabe des p38-MAP-Kinase Inhibitors SB202190 (10 µM) reduzierte die durch Smad4-Inhibition induzierte Hypertrophie auf 95,91 +- 7,48 % (n=16; p<0,05 vs. Antisense Smad4). Auch die Hemmung der PI3-Kinase mit dem spezifischen Inhibitor Wortmannin (10 nM) führt zur Reduk¬tion der Antisens-Smad4-induzierten Hypertrophie auf Kontrollniveau. Hingegen konnte der Einsatz des ERK Inhibitors PD98059 (10 µM) und des PKC Inhibitors Gö6976 (100 nM) die Proteinsyntheserate nicht senken (Antisense-Smad4 117,66 +- 4,99 %; n=10, Antisense-Smad4 + PD 117,05 +- 9,44 %; n=11). Darüber hinaus zeigten Zellen, die mit Smad4-Antisense-Oligonukleotiden transformiert wurden, eine Verschlechterung der kontraktilen Funktion (dL/L Ktr. 10,43 +-; 0,49% vs. Antisense-Smad4 8,83 +- 0,48%; n=22-24; p<0,05). Die Reduktion der Zellverkürzung konnte durch Hemmung der p38-MAP-Kinase auf das Kontrollniveau zurückgeführt werden.Schlussfolgerung: Der Transkriptionsfaktor Smad4 ist nicht an einer alpha-adrenerg vermittelten Hypertrophie beteiligt. Vielmehr führt die Inhibition von Smad4 basal schon zu einer gesteigerten Proteinsyntheserate, die p38-MAP-Kinase und PI3-Kinase abhängig ist. Weiterhin führt eine Smad4 vermittelte Hypertrophie zur Verschlechterung der Kontraktilität, die über p38-MAP-Kinase reguliert wird. Somit verhindert Smad4 ein hypertrophes Wachstum und eine kontraktile Dysfunktion der Kardiomyozyten unter basalen, unstimulierten Bedingungen. Damit kommt Smad4 eine Schlüsselfunktion bei der Kontrolle der Hypertrophie von adulten Kardiomyozyten zu. Hypertrophic growth represents a protection of the heart against increased load. However, development of hypertrophy can result in decompensation and deterioration of heart function. Several studies show, that Smad proteins are enhanced during cardiac remodelling and that they may be involved in this process. The aim of this study was to analyze the relevance of Smad4 in the development of cardiac hypertrophy.To study, if Smad4 plays a role in cardiac hypertrophy we induced a functional knock-out of Smad4 in adult cardiomyocytes of rat by use of antisense Smad4 oligonucleotides. Transformation of cells with antisense Smad4 reduced Smad4 protein expression after 28 h to 34.68 +- 7.07 % (n=4) and after 48 h to 10.75 +- 2.69 % (n=3). The rate of protein synthesis as a marker of hypertrophic growth was measured as incorporation of 14C-phenylalanin 28 h after incubation of cells with antisense Smad4 oligonucleotides. In comparison to controls protein synthesis increased after inhibition of Smad4 to 133.87 +- 15.75 % (n=24; p<0.05). Adrenergic stimulation with phenylephrine (PE) enhanced protein synthesis rate to 152.37 +- 5.66 (n=22; p<0.001). Simultaneous transformation of cells with antisense Smad4 and stimulation with PE elevated protein synthesis rate to the same extent 162.52 +- 9.72 %, n=24; p<0.001). To analyze, which pathways are involved in Smad4 dependent hypertrophy, several kinase inhibitors were applied. The addition of p38-MAP-kinase inhibitor SB202190 (10 µM) reduced Smad4 induced hypertrophy to 95.91 +- 7.48 % (n=16; p<0.05 vs. antisense Smad4). Furthermore, inhibition of PI3-kinase with Wortmannin (10 nM) resulted in reduction of antisense Smad4 induced hypertrophy to control level. However use of ERK inhibitor PD98059 (10 µM) and PKC inhibitor Gö6976 (100 nM) could not decrease the rate of protein synthesis (antisense Smad4 117.66 +- 4.99 %; n=10; antisense Smad4 + PD 117.05 +- 9.44 %; n=11). In addition to the hypertrophy effects of Smad4 contractile function of cardiomyocytes that were incubated with antisense Smad4 was attenuated (dL/L Ctr. 10.43 +- 0.49% vs. antisense Smad4 8.83 +- 0.48%; n=22-24; p<0 .05). Reduction of cell shortening could be abolished by inhibition of p38-MAP-Kinase.In conclusion inhibition of Smad4 has no influence on alpha-adrenergic mediated hypertrophy but leads to increased hypertrophic growth in unstimulated cardiomyocytes that depends on p38-MAP-kinase and PI3-kinase. Also, antisense Smad4 induced hypertrophy resulted in deterioration of contractile function via p38-MAP-kinsae. Therefore, Smad4 acts as a repressor of hypertrophy and contractile dysfunction under basal, unstimulated conditions. This characterizes a key role of Smad4 in the control of hypertrophy in adult cardiomyocytes.