Untersuchungen zur Interaktion von humanen polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten und inflammatorisch vorbehandelten intestinalen Epithelzellen am Beispiel von CaCo-2B-Zellen

Abstract

Native CaCo-2B-Zellen sind in der Lage, die destruktiven granulozytären Zelleraktionen abzuschwächen, wenn sowohl die neutrophilen Granulozyten als auch die CaCo-2B-Zellen durch das Calciuminonophor A 23187 aktiviert werden (160). In der vorliegenden Arbeit konnte jetzt aufgezeigt werden, dass auch die Vorbehandlung der CaCo-2B-Zellen mit proinflammatorischen Mediatoren dieses Interaktionsmuster nicht verändert. Bekannt ist, dass die Verminderung der nachweisbaren granulozytären Elastase und Sauerstoffradikale bei Co-Inkubation von PMN und nativen CaCo-2B-Zellen mit grosser Wahrscheinlichkeit durch NO vermittelt wird (160). Nach Auswertung der vorliegenden Ergebnisse vermuten wir, dass dies auch bei vorbehandelten CaCo-2B-Zellen der Fall ist. Die Inkubation der CaCo-2B-Zellen mit TNF& bzw. den Zytokingemischen führte über die sehr wahrscheinliche Induktion der iNOS zur Synthese großer Mengen NO. LPS induzierte einen nicht-signifikanten Anstieg der NO-Synthese, den wir einer geringeren Aktivierung der iNOS zuschreiben. Parallel erwarten wir in allen Versuchsreihen nach Stimulation mit A 23187 auch eine Aktivierung der cNOS in den CaCo-2B-Zellen. In Folge einer erhöhten NO-Konzentration könnte zum einen die membranständige Komponente der granulozytären NADPH-Oxidase gehemmt worden sein. Zum anderen könnte NO mit dem Superoxid-Anion zu dem instabilen Peroxynitrit reagiert haben, das rasch zum chemisch inierten Nitrat und Nitrit zerfällt. Daten, die das Dominieren eines der Reaktionswege nachweisen, liegen bislang nicht vor. Weiterhin ist anzunehmen, dass über diese Mechanismen hinaus neben dem NO der iNOS das von der cNOS synthetisierte NO an der Supprimierung der granulozytären Sauerstoffradikalbildung beteiligt ist. Klinische Daten lassen zusätzlich vermuten, dass das durch die cNOS synthetisierte NO auch unter inflammatorischen Bedingungen weiterhin antiinflammatorische und homöostatische Funktionen erfüllt (109,183,199). Reaktionen, über die NO direkt die granulozytäre Elastasesekretion hemmen kann, sind derzeit unklar. Der hypothetische Mechanismus über eine Aktivierung des Leukozyten-Serinprotease-Inhibitors bleibt weiterhin spekulativ. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob die Co-Inkubation von nativen und vorbehandelten CaCo-2B-Zellen und PMN und nachfolgende Stimulation mit A 23187 einen Einfluss auf die granulozytäre Leukotriensynthese hat. Die Co-Inkubation LPS-vorbehandelter CaCo-2B-Zellen mit PMN führte zu einer massiven Amplifizierung der granulozytären Leukotriensynthese. Der Mechanismus der kooperativen Eicosanoidsynthese zwischen PMN und LPS-vorbehandelten CaCo-2B-Zellen ist vorerst noch hypothetisch. Wir postulieren eine erhöhte Kapazität der PLA2, wobei über den Anteil der sPLA2 und cPLA2 keine Aussage getroffen werden kann. Interessant erscheint allerdings der Hinweis, dass klinische Untersuchungen der letzten Jahre eine bedeutende pathogenetische Rolle der sPLA2 in der Genese von CED nachgewiesen haben (199-201). Zytokin-vorbehandelte CaCo-2B-Zellen zeigten einen supprimierenden Einfluss auf die granulozytäre Leukotriensynthese. Dies ließe sich durch eine fehlende kooperative Eicosanoidsynthese in Kombination mit einem direkten hemmenden Einfluss Zytokin-vorbehandelter CaCo-2B-Zellen auf die granulozytäre Leukotriensynthese zu erklären. Wie diese hypothetischen Mechanismen im Detail ablaufen und ob möglicherweise NO auch hier eine wichtige Rolle spielt, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden. Native CaCo-2B-cells are able to mitigate destructive granulocytic cell reactions provided both the neutrophil granulocytes and the CaCo-2B-cells are activated by calcium ionophore A 23187 (160). This work shows that even pretreatment of the CaCo-2B-cells with proinflammatory mediators does not change this pattern of interaction. It is known that the reduction of detectable granulocytic elastase and oxygen radicals during the co-incubation of PMN and native CaCo-2B-cells is most probably precipitated by NO (160). Since evaluating the available results, we assume that this is also the case with pre-treated CaCo-2B-cells. The incubation of CaCo-2B-cells with TNF& and cytokine mixtures respectively led to the synthesis of large quantities of NO, most likely due to the induction of iNOS. LPS induced an insignificant increase in NO synthesis, which we attribute to a lesser degree of iNOS activation. Parallel to this, we expect that every series of experiments will show that cNOS is activated in the CaCo-2B-cells after stimulation with A 23187. Firstly, increased concentrations of NO could have inhibited the membranous components of granulocytic NADPH oxidase. Secondly, NO could have reacted with the superoxide anion to form peroxynitrite, which is unstable and rapidly decomposes into chemically inert nitrate and nitrite. As yet, there is no data to indicate that either of these reaction paths predominates. In addition to these mechanisms, it is presumed that both the NO synthesized via iNOS and the NO synthesised via cNOS play a part in the inhibition of granulocytic oxygen radical formation. Moreover, clinical data provide grounds for the assumption that the NO synthesized via cNOS performs anti-inflammatory and homeostatic functions even in inflammatory conditions (109,183,199). Reactions by means of which the NO could directly inhibit the secretion of granulocytic elastase are as yet unclear. The hypothetical mechanism involving the activation of leukocyte serine protease inhibitors is still a matter of speculation. The second part of this work examines whether the co-incubation of native and pre-treated CaCo-2B-cells and PMN and subsequent stimulation with A 23187 can exert an influence on granulocytic leukotriene synthesis. The co-incubation of PMN and CaCo-2B-cells pretreated with LPS led to a massive increase in granulocytic leukotriene synthesis. At present, the mechanism of cooperative eicosanoid synthesis between PMN and CaCo-2B-cells pre-treated with LPS is still hypothetical. We suggest an increase in PLA2 capacities, although no statement can be made concerning the proportions of sPLA2 and cPLA2. However, it is interesting to note that clinical tests performed in recent years have demonstrated that sPLA2 plays a significant pathogenetic role in the etiology of CED (199-201). CaCo-2B-cells pretreated with cytokines were showed to inhibit granulocytic leukotriene synthesis. This could be explained by the lack of cooperative eicosanoid synthesis in combination with the directly inhibitive effect of CaCo-2B-cells pretreated with cytokines on granulocytic leukotriene synthesis. At present, no explanation is available as to the detailed progression of these hypothetical mechanisms and whether NO also plays an important part in this context.