Endoplasmic Reticulum (ER)-stress signalling in the alveolar epithelium

Abstract

Endoplasmic Reticulum (ER)-stress, the accumulation of misfolded proteins in the ER, is assumed to be the cause of several diseases. Recently, enough evidence accumulated to state that it also plays an important role in idiopathic pulmonary fibrosis (IPF). The presence of a maladaptive ER-stress in the alveolar epithelial type II cells (AECII) of patient´s lungs has been demonstrated and the ability of this mechanism to cause or enhance a fibrotic phenotype has been shown. The hypothesis that AECII apoptosis induced by ER-stress or alternative mechanisms is a main trigger of this disastrous disease is therefore widely accepted. Nevertheless it was a requirement to characterize the diverse pathways of ER stress response (the unfolded protein response, UPR) in the alveolar epithelium in detail. My studies focus on, but are not limited to, the effects of the UPR- transcription factors Atf4, Atf6 and Xbp1 in vitro in the AECII-derived murine cell line MLE12 and in vivo with conditional over-expression in transgenic mouse lungs of de novo generated lines. A broad analysis of the transgene-effect in vitro was assessed, based on microarray analysis of transfected cells, including miRNA analysis and 400K-Exonarrays, which provide first evidence that regulation of miRNAs and alternative splicing events are components of the UPR. Induction of cell death by the UPR-transcription factors was of special interest, because it is a proposed mechanism in the pathogenesis of IPF. However, no increased cell death or strong induction of the pro apoptotic mediator Chop (gene for the C/EBP Homologous Protein; CHOP) was observed, the protective effects seemed to dominate in the system. Atf4, Atf6 and Xbp1 are not sufficient to mimic or generate a maladaptive ER stress situation in these cells. In experiments with drug (Thapsigargin, Brefeldin A) induced ER-stress the induction of Chop was one of the earliest effects and occurred simultaneously with the induction of Atf4 and Xbp1(s). Microarrays, addressing the very early effects of Thapsigargin (TG) treatment, could reveal an even earlier transcriptional regulation. However, it could not be determined which factors make the difference between a good and a maladaptive ER-stress. Other potential impact of ER Stress on IPF resulting from the expression data was discussed.Transgenic mice for inducible over-expression of Atf4, Atf6 and Xbp1 were generated. The investigated lines did not develop any phenotype after transgene induction. This would fit to the in vitro finding, that the transgenes do not cause AECII death. However, the extend of the transgene induction in vivo has not yet been completely assessed. Endoplasmatischer Reticulum (ER)-Stress, die Akkumulation fehlgefalteter Proteine im ER, wird als Ursache einer ganzen Reihe von Krankheiten angesehen. In letzter Zeit haben sich genug Belege angesammelt, dass er auch eine wichtige Rolle in der idiopathischen pulmonalen Fibrose (IPF) spielt. Die Präsenz eines maladaptiven ER-Stress in den alveolären Typ II Zellen (AECII) von Patientenlungen und die Fähigkeit dieses Mechanismus einen fibrotischen Phänotyp zu erzeugen oder zu verstärken, wurden gezeigt. Die Hypothese, dass durch ER-Stress oder alternative Mechanismen induzierte AECII Apoptose, ein Hauptfaktor bei dieser tödlichen Krankheit ist, wird daher weitgehend anerkannt. Dennoch war es erforderlich, die diversen Wege der ER-Stress Antwort (UPR) in AECII detailliert zu charakterisieren. Meine Forschungen waren auf die Effekte der UPR-Transkriptionsfaktoren Atf4, Atf6 und Xbp1 in vitro in der murinen Zelllinie MLE12 fokussiert aber nicht darauf begrenzt. Sie umfassten in vivo die konditionale Überexpression dieser Faktoren in den Lungen de novo generierter transgener Mauslinien. Eine breit angelegte Analyse der Transgeneffekte in vitro, wurde basierend auf Microarray-Analysen transfizierter Zellen, inklusive 400K Exonarrays und miRNA-Arrays, vorgenommen, die erste Belege liefern, dass miRNA Regulation und alternatives Spleißen Teile der UPR sind. Induktion von Zelltod durch diese UPR Transkriptionsfaktoren wird im engen Zusammenhang mit der Pathogenese von IPF diskutiert. Daher wurde Zelltod durch UPR-Transkriptionsfaktoren näher untersucht. Allerdings wurde kein verstärkter Zelltod oder eine starke Induktion des proapoptotischen Mediators CHOP beobachtet, die schützenden Effekte schienen in diesem System zu dominieren. Atf4, Atf6 und Xbp1 sind nicht hinreichend, um eine maladaptive ER-Stresssituation in diesen Zellen zu simulieren oder zu erzeugen. In Experimenten mit durch Chemikalien (Brefeldin A, Thapsigargin) erzeugtem ER-Stress war die Induktion von CHOP eines der frühesten Ereignisse und trat simultan mit der Induktion von Atf4 und Xbp1(s) auf. Microarrays, die auf die sehr frühen Effekte von Thapsigarginbehandlung abzielten, konnten noch frühere, transkriptionale Reaktionen zeigen. Allerdings konnte nicht bestimmt werden, welche Faktoren den Unterschied zwischen einem guten und einem maladaptiven ER-Stress ausmachen. Andere potentielle Einflüsse von ER Stress auf IPF, die sich aus den Expressionsdaten ergaben, wurden diskutiert. Transgene Mäuse für die induzierbare Überexpression von Atf4, Atf6 und Xbp1 wurden generiert. Die untersuchten Linien entwickelten keinerlei Phänotyp als Reaktion auf die Transgeninduktion. Das würde zu den in vitro Befunden passen, dass die Transgene keinen AECII-Zelltod erzeugen. Allerdings wurde das Ausmaß der Transgeninduktion in vivo noch nicht vollständig untersucht.