Experimentelle Untersuchungen zum pulmonalen Hochdruck : die Bedeutung der Hypoxie-induzierbaren Faktoren für pulmonalvaskuläre Remodellingprozesse in pulmonalarteriellen Fibroblasten

Abstract

Die Hypoxie induzierte Proliferation der pulmonalarteriellen Fibroblasten in der Adventitia der kleinen intrapulmonalen Arterien ist als frühes Stadium in der Entwicklung der pulmonalen Hypertonie und des Cor pulmonale beschrieben worden. Wir untersuchten die Rolle der Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF-1alpha und HIF-2alpha) in primären humanen pulmonalarteriellen Fibroblasten (FB-PA) unter hypoxischen Bedingungen. Der Schwerpunkt lag in der Differenzierung zwischen den beiden HIF-Isoformen und die Bedeutung der Inhibition für die pathophysiologische Reaktion der PA-FB unter Hypoxie. Dazu wurde zunächst die RNA interferenz zur Inhibition von HIF an den humanen Adenokarzinomzellen (A549) etabliert. Es zeigte sich eine potente Inhibition von HIF-1alpha, die Auswirkungen auf die Zellzyklusregulation unter Hypoxie hatte. Vor der Anwendung dieser Methode an den primären Zellen wurden zunächst die Reaktion der PA-FB auf Hypoxie und die Expression der Hypoxie-induzierbaren Faktoren untersucht. Unter hypoxischen Bedingungen reagierten die PA-FB mit einer starken proliferativen Antwort. Im Zellzyklus bewirkte die Hypoxie eine Verschiebung der PA-FB in die S-Phase, wobei die Apoptose gleichzeitig supprimiert wurde. Neben der Steigerung der Proliferation induzierte Hypoxie auch die Migration der PA-FB. Die Expression von alpha-Smooth-Muscle-Cell Aktin, als Indikator der Transdifferenzierung zu Myofibroblasten, blieb jedoch unverändert. Die folgende Analyse der Expression konnte HIF-1alpha und HIF-2alpha auf mRNA-Ebene konstitutiv nachweisen. Auf Protein-Ebene zeigten beide HIF-Isoformen eine starke Induktion unter Hypoxie und unter normoxischen konnte nur das HIF-2alpha Protein zytosolisch und perinukleäre nachgewiesen werden. Die Aktivierung der beiden Subtypen und somit die Funktionalität als Transkriptionsfaktor wurde mittel RT-PCR für die Zielgene von HIF-1alpha und HIF-2alpha dargestellt. Durch siRNA für HIF-1alpha und HIF-2 wurde diese Aktivierung sowohl für die Phosphoglycerat Kinase (PGK), als auch für den Vascular endothelial growth factor (VEGF) inhibiert. Weiterhin bedingte die Suppression von HIF-1alpha, wie auch von HIF-2alpha einen Stopp der Hypoxie induzierten Migration, wobei die Proliferation nur durch siRNA gegen HIF-2alpha zu inhibieren war. PA-FB proliferieren und migrieren unter Hypoxie HIF gesteuert, so dass eine Transdifferenzierung in der Media der pulmonalarteriellen Gefäße ermöglicht wird. Die Proliferation ist dabei abhängig von HIF-2alpha während die Migration durch HIF-1alpha und HIF-2alpha gesteuert wird. Die Transdifferenzierung in PA-FB ist weder direkt durch Hypoxie induziert noch HIF abhängig. Diese Ergebnisse demonstrieren die wichtige Bedeutung der Hypoxie induzierten Faktoren in den PA-FB für die Entwicklung der pulmonalen Hypertonie. Proliferation of adventitial fibroblasts of small intrapulmonary arteries (PA-FB) has been disclosed as an early event in the development of pulmonary hypertension and cor pulmonale in response to hypoxia. We investigated the role of hypoxia-inducible transcription factors (HIF) in human PA-FB exposed to hypoxia. Particular attention was paid to a putative role of hypoxia-inducible factors, with two major acting subtypes being currently known (HIF-1alpha, HIF-2alpha). Both subtypes regulate their target gene via the hypoxia-responsive elements (HRE). For determination between the different HIF Isoforms RNA-interference for HIF-1alpha and HIF-1alpha was established using the human adenocarcinoma cell line A549. In this system a potent inhibition of HIF-1alpha with consequences in cell cycle regulation was observed.Further investigations with primary cultures of PA-FB displayed a strong mitogenic response to 24 h of hypoxia, whereas the rate of apoptosis was significantly suppressed. In addition, the migration of PA-FB was strongly increased under hypoxic conditions but not the expression of alpha-smooth muscle cell actin. Hypoxia induced a marked up-regulation (protein level) of both HIF-1alpha and HIF- 2alpha, alongside with nuclear translocation of these transcription factors. Specific inhibition of either HIF-1alpha or HIF-2alpha was achieved by RNA interference technology, as proven by HIF-1alpha and HIF-2alpha mRNA and protein analysis and expression analysis of HIF downstream target genes. With the use of this approach, the hypoxia-induced proliferative response of the PA-FB was found to be solely HIF-2alpha dependent, whereas the migratory response was significantly reduced by both HIF-1alpha and HIF-2alpha interference. In conclusion, HIF up-regulation is essential for hypoxic cellular responses in human pulmonary artery adventitial fibroblasts such as proliferation and migration, mimicking the pulmonary hypertensive phenotype in vivo. Differential HIF subtype dependency was noted, with HIF-2alpha playing a predominant role, which may offer future intervention strategies.