Quantifizierung mitochondrialer DNA in humanen Leukozyten unter antiretroviraler Therapie der HIV-Infektion

Abstract

Hintergrund. Das humane Immundefizienzvirus (HIV) ruft persistierende Infektionen hervor, die unbehandelt nach unterschiedlich langer Latenzzeit zur AIDS-Erkrankung und zum Tode führen. In den letzten Jahrzehnten wurden zunehmend bessere Therapieschemata entwickelt, die die Vermehrung von HIV unterbinden, das Virus aber nicht vollständig aus dem Organismus entfernen können. Daher ist eine Dauertherapie nötig. Hauptkomponenten aller Therapien sind nukleos/tidische Inhibitoren der viralen Reversen Transkriptase (abgekürzt NRTI). Einige dieser Inhibitoren hemmen auch die DNS-Polymerase gamma der zellulären Mitochondrien und bewirken dort eine Abnahme sowie Schäden der mitochondrialen DNA (mtDNA), die ihrerseits zu Funktionsausfällen führen. Nach mehreren Monaten Therapie können sich bei einem Teil der Patienten lebensbedrohliche Stoffwechselstörungen zeigen, Fragestellung. Ziel der Arbeit war es, eine Methode zur genauen Messung des mtDNA-Gehalts pro Zelle zu entwickeln und diese Methode zur Verlaufsbeobachtung bei 90 HIV-Patienten einer multizentrischen Studie unter 3 verschiedenen Therapie-Regimen einzusetzen. Daneben sollte auch geprüft werden, ob im Serum und den PBMC der Patienten das Cytomegalovirus (CMV) nachweisbar war, da dieses ein bekannter opportunistischer Krankheitserreger bei HIV-Patienten ist. Methoden und Patienten. Als Untersuchungsmaterial dienten periphere monozytäre Blutzellen (PBMC) der Patienten zum Zeitpunkt 0, 24, und 48 Wochen. Die DNA wurde aus diesen Proben extrahiert und ihr Gehalt an mtDNA sowie einer zellkernständigen DNA (nDNA, hier des H-ras Gens) durch eine quantitative PCR im LightCycler System (Roche Diagnostics) gemessen. Das Verhältnis mt/nDNA sollte ein Maß für die Schädigung der Mitochondrien sein. Auch die Menge des CMV wurde mit dieser Methode bestimmt. Es standen entgegen dem ursprünglichen Plan aber nur 35 PMBC Proben von 13 Patienten zur Verfügung, da die Studie weit vor der Zeit abgebrochen wurde. Daneben wurden die PBMC von 8 gesunden Probanden untersucht.Diskussion. Zu Beginn der Arbeit im August 2004 erschien das Projekt sehr aussichtsreich, jedoch erwies sich diese Einschätzung als falsch. Die Methodik selbst war anspruchsvoll, aber machbar und ausreichend genau. Die Studie wurde jedoch wegen der medizinisch indizierten Verwendung weniger toxischer Mittel abgebrochen. Retrospektiv muss dies nicht bedauert werden. Die Sichtung der Literatur im Jahr 2012 zu diesem Thema zeigt, dass sehr viele Forscher in den vergangenen 8 Jahren die gleiche Fragestellung aufgegriffen haben, zum Teil sehr umfangreiche Kollektive mit ähnlicher Methodik untersucht haben und dennoch äußerst heterogene Ergebnisse berichten. Bei kritischer Bewertung aus heutiger Sicht kristallisiert sich heraus, dass PBMCs kein geeignetes Material für diese Fragestellung sind, weil die Menge der mtDNA pro Zelle keinen klaren Bezug zu den Funktionsausfällen zeigt, sondern eher die Aktivität und Genauigkeit der mitochondrialen Gen-Expression. Diese komplexen Zusammenhänge machen es verständlich, dass die mtDNA Menge in PBMCs auch keinen klaren Bezug zu den klinisch beobachteten Nebenwirkungen der NRTI-Therapie haben kann. Dazu kommt noch, dass HIV selbst durch Förderung der Apoptoseneigung eine Vorschädigung der mtDNA bewirken kann und in der Therapiephase dann möglicherweise die mitochondriale Toxizität der NRTI noch erhöht. Mit dieser Sichtweise erscheinen die Ergebnisse der Dissertation plausibel. Wegen der zu geringen Fallzahl war jedoch kein klärender Beitrag zur Literatur möglich. Background. The human immunodeficiency virus causes persistent infections which if not treated, after variable latent periods lead to the clinical picture of the fatal AIDS disease. In the last decades steadily improved schemes of therapy were developed, which inhibit the replication of the virus but do not eradicate the virus from the human body, which makes the continuous therapy mandatory. The main components of such therapies are nucleoside/nucleotide inhibitors of the viral reverse transcriptase (NRTI). Some of these inhibitors also inhibit the DNA-polymerase gamma of the cellular mitochondria, which decreases and damages the mitochondrial DNA (mtDNA) with subsequent mitochondrial failure.After some months of therapy some patients develop life threatening metabolic disorders including acidosis and lactic acidosis, moreover an irreversible damage of the muscle, fat and nervous tissue can occur.Objective. The target of this study was to develop a method for an accurate measurement of the cellular mtDNA amount and to use that method for follow-up of 90 patients of a multicentre study receiving three different therapeutic regimes. The results should enable an early preclinical detection of any mitochondrial damage indicating a change of the current therapy. Furthermore, CMV, a well-known opportunistic infection of HIV-patients, should be determined in the serum and the peripheral blood mononuclear cells (PBMC).Method and patients. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of the patients were examined after 0, 24 and 48 weeks of treatment. The DNA of these cells was extracted and its contents of the mtDNA along with nuclear DNA (nDNA, her the H-ras gene) were measured through a quantitative PCR using the LightCycler System (Roche Diagnostics). The proportion mt/nDNA was used as a measure of the mitochondrial damage. The amount of the CMV was also measured by the same method. Contrary to the original plan, there were only 35 PBMCs of 13 patients to be examined as the study has been prematurely discontinued. PBMC of 8 healthy candidates were examined as well.Results. In comparison to the 8 healthy candidates with 642 ± 245 mtDNA copies per cell, there was a higher value in 5 HIV-patients at the beginning of the therapy (highest value 2627), and a lower in 3 patients (lowest value 114). Mean value and standard deviation were 949 ± 750 which is corresponding to the mean value in the healthy controls but the standard deviation was significantly larger in the patients. The mtDNA of the 4 patients with sufficient data, showed no correlation to the viral load. This is not unexpected as during the therapy all patient were HIV RNA negative.The effects of treatment were heterogeneousDiscussion: At the beginning of the study in August 2004 the project looked promising, however this proved untrue. The methods were sophisticated, but feasible and sufficiently accurate. However, the study was discontinued because of the application of less toxic substances. In retrospect, this is actually not to be regretted. A review of the literature for this topic in 2012 revealed that so many researchers in the last eight years considered this topic with large patient cohorts and similar methods but reported utmost heterogenous results. According to todays knowledge a critical assessment reveals that PBMCs are unsuitable materials for this subject, as the amount of the mtDNA per cell does not correlate visibly to the functional deficits of the cell, but rather the activity and the accuracy of the mitochondrial gene expression. These complex relations may explain the finding that the amount of the mtDNA in PBMCs has no visible correlation to the clinically noticed side effects of the NRTI-therapy. Moreover the HIV itself promotes the apoptosis and hence causes a predamage of the mtDNA which in turn increases the NRTI-toxicity of the mitochondria during the therapy. The results of this doctoral dissertation seem then to be plausible from this point of view. Due to the small number of cases a relevant addition to the literature could not be achieved.