Characterization of the TGF-beta signalosome and of TGF-beta-dependent endometrial cell proliferation

Abstract

Endometriosis is characterized by the presence of endometrial-like cells outside the uterus mostly in the ovary and peritoneum. TGF-betas are expressed significantly higher in the serum and peritoneal fluid of patients with endometriosis. TGF-betas have been also observed in endometriotic sites. Thus, TGF-betas might be involved in the pathogenesis of endometriosis. The aim of this study was to investigate the signaling pathways of the TGF-betas and possible cross-talks with other pathways. Also, we investigated the interaction of the TGF-betas to their receptors. In this study, we used four different cell lines including endometrial epithelial and stromal cell lines, endometriotic epithelial and stromal cell lines and primary endometrial stromal cells. Also, endometrial and ovarian tissues were used. Our results showed that in all four cell lines and primary cells studied: (1) TGF-beta1 or TGF-beta2 decreased cell numbers in all cells and the reduction was higher in endometrial cells compared to endometriotic cells, (2) TGF-beta1 or TGF-beta2 induced apoptosis in all cells with no significant differences between endometrial or endometriotic cells, (3) TGF-beta1 or TGF-beta2 induced Smad3 phosphorylation in all cells studied with higher phosphorylation levels observed in endometrial cells compared to endometriotic cells, (4) a TbetaRI inhibitor completely blocked the TGF-beta-induced reduction in cell numbers, apoptosis, PAI-1 secretion and Smad3 phosphorylation. A Smad3 inhibitor only partly blocked it. (5) TGF-beta1 or TGF-beta2 increased TBRII and TBRIII or TBRI and TBRII interaction with a stronger interaction observed in endometrial cells compared to endometriotic cells. (6) A BMP as well as an ALK-2 inhibitor completely blocked the TGF-beta-induced PAI-1 secretion. In contrast, ALK-3 and ALK-6 inhibitors only partly blocked it. (7) A JNK inhibitor blocked increased secretion of TGF-beta2 and TGF-beta1 in TGF-beta1-treated cells. (8) Both endometrial glands and ovarian endometriotic foci express CK 18 and MUC1 proteins.From these results, we suppose that the reduced responsiveness upon TGF-beta treatment observed in endometriotic cells compared to endometrial cells in regard to reduction in cell numbers, Smad3 phosphorylation and TBR receptor interaction indicates that endometriotic cells are more resistant to TGF-beta signals. This suggests that endometriotic cells might acquire tumor-like characteristics which might contribute to their survival, evasion of the immune system and subsequent implantation during the pathogenesis of endometriosis. In addition, we provided evidence that endometriotic cells have possibly the same origin from endometrial cells and thus are disseminated like tumor cells. Furthermore, we demonstrated for the first time that endometrial and endometriotic cells undergo apoptosis upon TGF-beta treatment and both intrinsic and extrinsic pathways are involved. In addition, we demonstrated the participation of the JNK and BMP pathways in TGF-beta signaling in endometrial, endometriotic and primary endometrial stromal cells. These findings might provide new insights into the roles of TGF-betas in the pathophysiology of endometriosis. However, more studies are needed on BMP and JNK pathways in TGF-beta signaling in endometrial, endometriotic and primary cells to elucidate the connection between BMP or JNK with TGF-beta since our study only gave a first glimpse into involvement in TGF-beta signaling in endometrial, endometriotic and primary endometrial stromal cells. Endometriose ist charakterisiert durch die Anwesenheit von endometrium-ähnlichen Zellen ausserhalb des Uterus meistens im Ovar und im Peritoneum. TGF-betas sind signifikant stärker exprimiert im Serum und Peritonealflüssigkeit von Patienten mit Endometriose. TGF-betas wurden auch beobachtet an endometriotischen Stellen und könnten deshalb in der Pathogenese der Endometriose involviert sein. Das Ziel der Studie war die Untersuchung der Signalwege der TGF-betas und mögliche Wechselwirkungen mit anderen Signalwegen. Ebenso analysierten wir die Interaktion der TGF-betas mit ihren Rezeptoren. In dieser Studie nutzten wir vier verschiedene Zelllinien eingeschlossen endometriale epitheliale und stromale Zelllinien, endometriotische epitheliale and stromale Zelllinien und primäre endometriale stromale Zellen. Ebenso wurden endometriale und ovarielle Gewebe verwendet. Unsere Resultate zeigten in allen untersuchten vier Zelllinien und den primären Zellen: (1) TGF-beta1 oder TGF-beta2 verminderten die Zellzahlen in allen Zelllinien und die Reduktion war höher in den endometrialen Zelllinien verglichen mit den endometriotischen Zelllinien, (2) TGF-beta1 oder TGF-beta2 induzierten die Apoptose in allen Zelllinien mit keinem signifikanten Unterschied zwischen endometrialen oder endometriotischen Zellen, (3) TGF-beta1 oder TGF-beta2 induzierten die Phosphorylierung von Smad3 in allen untersuchten Zellen mit höheren Phoshorylierungsspiegeln in endometrialen Zellen verglichen zu endometriotischen Zellen, (4) ein TbetaRI Inhibitor blockierte komplett die TGF-beta-induzierte Reduktion der Zellzahlen, der Apoptose, der PAI-1 Sekretion und der Smad3 Phosphorylierung. Ein Smad3 Inhibitor dagegen blockierte nur teilweise. (5) TGF-beta1 oder TGF-beta2 erhöhten die Interaktion von TBRII mit TBRIII oder von TBRI mit TBRII mit einer stärkeren Interaktion in den endometrialen Zellen verglichen mit den endometriotischen Zellen. (6) Ein BMP als auch ein ALK-2 Inhibitor inhibierte vollständig die TGF-beta-induzierte PAI-1 Sekretion. Im Gegensatz dazu blockierten ein ALK-3 oder ein ALK-6 Inhibitor nur teilweise. (7) Ein JNK Inhibitor blockierte die erhöhte Sekretion von TGF-beta2 und TGF-beta1 in TGF-beta1-behandelten Zellen. (8) Sowohl endometriale Drüsen als auch ovarielle endometriotische Foci exprimieren die Proteine CK 18 und MUC1.Ausgehend von diesen Resultaten vermuten wir, dass die reduzierte Responsivität nach TGF-beta Stimulation beobachtet in endometriotischen Zellen im Vergleich zu endometrialen Zellen bezüglich Reduktion der Zellzahlen, der Smad3 Phosphorylierung und TBR Rezeptor Interaktion darauf hinweist, dass endometriotische Zellen resistenter gegenüber TGF-beta Signalen sind. Das deutet daraufhin, dass endometriotische Zellen möglicherweise Tumor-ähnliche Eigenschaften erwerben, die beitragen zu ihrem Überleben, Umgehen des Immunsystems und der nachfolgenden Implantation während der Pathogenese der Endometriose. Zusätzlich zeigten wir, dass endometriotische Zellen möglicherweise alle von endometrialen Zellen abstammen und sich deshalb wie Tumorzellen ausbreiten. Des weiteren zeigten wir erstmalig, dass endometriale und endometriotische Zellen die Apoptose einleiten nach Stimulation mit TGF-betas und daran sowohl der intrinsische als auch der extrinsische Weg beteiligt sind. Ebenso konnten wir zeigen, dass es eine Beteiligung des JNK und BMP Signalwegs beim TGF-beta Signalweg gibt in endometrialen, endometriotischen und primären endometrialen stromalen Zellen. Diese Befunde erlauben möglichwerweise neue Einblicke in die Rolle der TGF-betas in der Pathophysiologie der Endometriose. Dennoch sind mehr Studien zu den BMP und JNK Signalwegen in endometrialen, endometriotischen und primären Zellen nötig um die Zusammenhänge zwischen BMP oder JNK mit den TGF-betas aufzuklären, weil unsere Studie nur einen ersten Eindruck in die Beteiligung der TGF-ß Signalwege in endometrialen, endometriotischen und primären endometrialen stromalen Zellen vermitteln konnte.