Die antivirale Therapie der chronischen Hepatitis B : Identifikation neuer Resistenzmutationen und Optimierung der Verlaufskontrolle

Abstract

Das Hepatitis-B-Virus (HBV) verursacht eine der häufigsten Viruserkrankungen weltweit.Unbehandelt führt die aktive chronische Hepatitis B fast immer zu ernstenLeberschädigungen, wie Leberfibrose oder -Zirrhose, mit fatalen Folgen, wie demhepatozellulären Karzinom. In dieser Arbeit wurde ein zuvor beschriebenes HBV-Isolat(150-1) aus einem Patienten mit chronischer Hepatitis B weiter analysiert, das gegen dieNukleotidanaloga Adefovir und Tenofovir auffällig hohe Resistenzen in vitro zeigte. Beidiesem Isolat 150-1 konnte in dieser Arbeit in der Primerdomäne der HBV-Polymerase dieMutation prT76S ermittelt werden, die als Sekundärmutation zusammen mit denPrimärmutationen in der Reversen Transkriptase (rtA181V und rtN236T) für die auffällighohe Resistenz des Klons gegen Tenofovir und Adefovir verantwortlich ist. Hierbei wurdeerstmalig eine Resistenzmutation gegen NA beschrieben, die sich in der Primer-Domäne derviralen Polymerase und damit außerhalb der Reversen Transkriptase befindet.Unabhängig davon wurden in zwei Studien in Zusammenarbeit mit der AG Roggendorf,Universitätsklinikum Essen, Therapieverläufe chronisch WHV-infizierter Woodchucks alsSurrrogat-Tiermodel für die Hepatitis B des Menschen untersucht. Diese wurden in einerersten Studie mit Entecavir und einer DNA-( prime-boost )-Vakzinierung zur Stimulation vonT-Zellen gegen T-Zell-Epitope des WHsAg und WHcAg therapiert. In der zweiten Studiewurden zusätzlich zu der Behandlung mit Entecavir und der DNA-Vakzinierung, spezifischeAntikörper gegen den Liganden (PD-L1) eines Selbstmord -Rezeptors (PD-1-Rezeptor) aufT-Zellen verabreicht, die einen Verlust ( Erschöpfung ) der relevanten T-Zell-Populationverhindern sollten. In dieser Arbeit wurde der Therapieerfolg, vergleichbar zur HBV-Therapie,anhand der WHsAg-Konzentration im Blut der Woodchucks mittels Laurell-Elektrophoreseermittelt. Die spezifische antivirale Immunreaktion bei den infizierten Woodchucks konntedurch die oben genannten Behandlungen stimuliert werden und führte bei einigen Tieren zueinem völligen Verschwinden des WHsAg auch nach Beendigung der Therapie. UnterEinbeziehung weiterer klinischer Parameter kann in diesen Fällen von einer Heilung derchronischen Hepatitis B im Tiermodell bei Woodchucks ausgegangen werden. DiesenUntersuchungen unterstreichen die Bedeutung der HBsAg-Bestimmung für die TherapieÜberwachungder chronischen Hepatitis. Daher wurden stabile, eukaryote Zelllinien zurHBsAg-Produktion des WHO-Genotypen-Panels hergestellt, wodurch es nun möglich ist invitro rekombinantes HBsAg in nahezu unlimitierten Mengen zu exprimieren, dasnachweislich im eigenen HBsAg-Testsystem, wie auch mit einem kommerziellendiagnostischen Test, wie dem qHBsAg-Test im System Architect , (Abbott), reagierte. Mitdiesem Panel können die Limitationen des WHO-Serum-Panels (limitierte Verfügbarbeit,Infektiosität, Heterogenität von humanen Serum-Proben) verbessert werden und neuauftretende, schlecht nachweisbare HBV-Varianten schneller integriert werden. The hepatitis B virus (HBV) causes one of the most common virus diseases worldwide. Anuntreated active chronic hepatitis B often leads to liver fibrosis or cirrhosis with fatalconsequences, e.g. development of hepatocellular carcinoma (HCC). The goal of this thesiswas to further analyze the previously described cloned HBV isolate 150-1 from a patient withchronic hepatitis B that shows noticeable high resistances against the nucleotide analoguesAdefovir and Tenofovir in vitro. In this thesis it could be shown that the mutation prT76S inthe primer domain of the HBV polymerase of the isolate 150-1 works as a secondarymutation together with the primary mutations within the reverse transcriptase (rtA181V andrtN236T) and is responsible for the extraordinary resistance of this clone against Tenofovirand Adefovir. Thereby for the first time a resistance mutation against NA was described thatlies in the primer domain of the viral polymerase and therefore outside the reversetranscriptase.Besides that, two studies were performed together with the AG Roggendorf, UniversityMedical Center Essen, to investigate experimental therapies in woodchucks chronicallyinfected with the related woodchuck hepatitis virus (WHV) as a surrogate model for humanhepatitis B. In the first study the woodchucks were treated with the NA Entecavir and a DNA-(prime-boost) vaccination for the stimulation of T cells against T cell epitopes of the WHVsurface (WHsAg) and core (WHcAg) antigen. In the second study additionally to thetreatment with Entecavir and the DNA vaccination specific antibodies against the ligand (PDL1)of a ´suicidal receptor (PD-1-Receptor) on T cells were given that should prevent theexhaustion of the relevant T cell population. In this thesis, success of therapy wasdetermined by quantification of the surface antigen concentration in the blood, comparable toHBV therapy using Laurell electrophoresis. Specific antiviral immune reaction in the infectedwoodchucks could be stimulated by the above-named treatment with total disappearance ofthe WHsAg in some animals even after stop of treatment. With the inclusion of further clinicalparameters, healing of chronic hepatitis B in the woodchuck model could be achieved, atleast in some cases.These results underline importance of HBsAg determination for therapy control of chronichepatitis B. Thus, the establishment of stable eukaryotic cell lines for HBsAg expression ofthe WHO HBV genotype panel allows production of recombinant SHBs in vitro in nearlyunlimited amounts, which reacted similarly in in-house tests and commercial quantitativediagnostic tests for HBsAg (Abbott Architect). With this panel the limitations of the WHOserum panel (like limited availability, infectivity, heterogeneity of human plasma samples)could be improved and adapted to emerging HBV variants in the future.