Nachweis von polysialylierten Glykoproteinen auf bovinen und humanen Spermien

Abstract

Polysialinsäure (PolySia), ein Homopolymer aus alpha2,8-verknüpften N-Acetylneuraminsäuren, ist bisher vor allem als essentieller Regulator von Adhäsionsprozessen im sich entwickelnden Säugerhirn bekannt. Dabei wurde PolySia als posttranslationale Modifikation zweier Proteine identifiziert: dem neuralen Zelladhäsionsmolekül NCAM und dem synaptischen Zelladhäsionsmolekül SynCAM 1. Da in Seeigel-Sperma bereits PolySia nachgewiesen werden konnte, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob PolySia auch auf Spermien von Säugetieren vorkommt. Erste Hinweise auf das Vorliegen von Oligo- und/oder PolySia lieferte der Nachweis interner Sialinsäuren (Sia) mit der C7/C9-Methode [Sato et al.; 1998]. Mittels milder DMB-Derivatisierung konnte verifiziert werden, dass die internen Sia-Reste Bestandteil von Sialinsäurpolymeren sind. Dabei wurden PolySia-Kettenlängen mit bis zu 46 Sia-Resten beim Rind und bis zu 49 beim Menschen bestimmt, was die Existenz von PolySia im bovinen und humanen Sperma beweist. Des Weiteren ergaben die Untersuchungen, dass die polysialylierten Glykoproteine sowohl bei bovinen als auch bei humanen Spermien auf der Oberfläche vorkommen und dass die alpha2,8-verknüpften PolySia-Ketten an N-Glykane der polysialylierten Glykoproteine gebunden sind.Durch Fluoreszenz-Mikroskopie konnten darüber hinaus die polysialylierten Glykokonjugate bei bovinen Spermien innerhalb der postakrosomalen Region lokalisiert werden. Bei humanen Spermien war PolySia ebenfalls in der postakrosomalen Region darstellbar, jedoch im Vergleich zu bovinen Spermien mehr in Richtung Hals verlagert.Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen zum ersten Mal, dass polysialylierte Glykoproteine auf Spermien von Säugetieren vorhanden sind. Somit wurde die Basis für weiterführende Studien hinsichtlich der Identifizierung der PolySia-Trägerproteine sowie deren PolySia-abhängige Funktionen auf Spermien geschaffen, die nachfolgend zur Identfizierung von NCAM und der Polysialyltransferase ST8SiaII als polysialylierte Proteine führte [Simon et al.; 2013]. Es ist nachgewiesen, dass PolySia sowohl Histon-vermittelte Zytotoxizität als auch einen als neutrophil extracellular trap (NET) bezeichneten Mechanismus, der ebenfalls zytotoxisch wirkt, abschwächen und sogar aufheben kann. Da diese Mechanismen nach der Insemination eine wichtige Rolle spielen, lässt sich somit eine wichtige immunmodulatorische Funktion von PolySia im weiblichen Genitaltrakt vermuten. Polysialic acid (polySia), a homopolymer consisting of alpha2,8-linked N-acetylneuraminic acids, is known as an essential regulator of adhesion processes in the developing mammalian brain. Here, polySia has been identified as a posttranslational modification of the neural cell adhesion molecule NCAM and the synaptic cell adhesion molecule SynCAM 1. Since polySia has also been detecteted in sea urchin sperm and is involved during fertilization processes, we wanted to investigate if polysialylated proteins are also localized at the surface of mammalian sperms.The first evidence for the presence of oligo- and/or polySia in mammalian semen was provided by the detection of internal sialic acid residues using the C7/C9-method [Sato et al.; 1998]. Subsequent mild DMB-derivatization showed that internal sialic acid residues are part of sialic acid polymers, of which the degree of polymerization ranged from ~ 46 sia residues in bovine up to ~ 49 sia residues in human semen. Thus, the existence of polySia in bovine and human semen was confirmed. Additional Western blot based experiments demonstrated that polysialylated glycoproteins were associated to bovine and human sperm and that alpha2,8-linked polySia chains were attached to N-glycans of these polysialylated glycoproteins. Furthermore, polysialylated glycoconjugates could be localized in the postacrosomal region of bovine and human sperms using fluorescence microscopy. In human sperm, however, the polySia positive area appeared to be more closely associated with the neck.In summary the results of this thesis demonstrated for the first time that polysialylated glycoproteins are present in the postacrosomal region of mammalian sperm. Based on these findings, further investigations allowed the identification of two polySia carriers, NCAM and the polysialyltransferase ST8SiaII, which are modified by the polysialyltransferases ST8SiaII and ST8SiaIV [Simon et al.; 2013]. Since polySia is known to counteract histone- as well as neutrophil extracellular trap (NET)-mediated cytotoxicity against host cells, which plays a role after insemination, we propose an immunomodulatoric function of polySia in the female reproduction tract.