Proteomanalyse von Milzlymphozyten bei Fat-1 und Wildtypmäusen nach Endotoxinstimulation

Abstract

Akute infektiöse pulmonale Erkrankungen wie die Pneumonie und das para-pneumonische akute Lungenversagen sind auch heute noch schwerwiegende Erkrankungen mit hoher Mortalität. Die Prävalenz des akuten Lungenversagens beträgt 12,5% aller Patienten, die länger als 24 Stunden auf der Intensivstation behandelt werden. Die Mortalitätsraten liegen zwischen 40 60%.Anhand von einer Studie mit Wildtypmäusen und FAT-1-Mäusen, die vermehrt n3-Fettsäuren produzieren, wurde durch inhalative Applikation von Pathogenitäts-faktoren im Mausmodell eine alveoläre Inflammation induziert. Die Milzlymphozyten der Mäuse wurden vor und zu definierten Zeitpunkten (4, 24 und 72 Stunden) nach der Applikation einer Proteomanalyse unterzogen. Hierzu werden Proteine mittels 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt und mittels Massenspektrometrie identifiziert.Insgesamt wurden 285 Proteine identifiziert, 82 Proteine davon aus Fat-1-Mäusen und 203 Proteine aus Wildtypmäusen. Davon wurden 30 Proteine aus Fat-1 Mäusen und 24 Proteine aus Wildtypmäusen identifiziert, die nach LPS Stimulation hochreguliert wurden. Die Expression von 12 Proteinen von Fat-1-Mäusen und 20 Proteinen von Wildtypmäusen wird herunterreguliert. 84 Proteine aus Wildtypmäusen wurden identifiziert, die nur nach LPS ( mit LPS ) exprimiert wurden, sowie 47 Proteine von Wildtypmäusen, die nur ohne eine LPS-Stimulation exprimiert wurden ( ohne LPS ). Bei den Fat-1-Mäusen wurden 26 Proteine identifiziert, die es nur nach erfolgter LPS-Stimulation ( mit LPS ) und 13 Proteine, die nur ohne LPS ( ohne LPS ) exprimiert werden. Die identifizierten Proteine sind in verschiedenen Stoffwechselwegen involviert: Signalübertragung, Transkription, Proteinstoffwechsel, Immunsystem, Strukturbildung, Translation, Chaperone und allgemeiner Stoffwechsel. Die identifizierten Proteine der FAT-1-Mäuse sind hauptsächlich an der Signalübertragung oder an der Translation beteiligt, oder stammen aus dem Bereich des Immunsystems. Die identifizierten Proteine der Wildtpmäuse haben hauptsächlich Funktionen als Hitzeschockprotein oder sind Teil des proteosomalen Abbaus. Die Proteomanalyse konnte zeigen, dass durch eine intratracheale LPS-Stimulation eine Regulierung der Proteinexpression in den Milz-Lymphozyten erfolgt.Die intratracheale Instillation von LPS erzeugt in Mäusen eine definierte und reproduzierbare alveoläre Inflammation, bei der es über 72 Stunden zu einer kontinuierlichen Invasion von Leukozyten aus dem Blut in das alveoläre Kompartiment kommt. Nach 72 h konnten in der Milz der intratracheal mit LPS behandelten Tiere auf Proteomebene erste Hinweise auf eine Apoptose-Induktion in Lymphozyten festgestellt werden. Die Identifizierung der Proteine bei den Fat-1-Mäusen zeigt, dass schneller und vermehrt Immunglobuline freigesetzt werden.Diese Proteomdaten liefern neue Erkenntnisse zur Regulation der durch alveoläre Deposition von Endotoxin induzierten pulmonalen Entzündungsreaktion auf Proteinebene liefern, die eine Identifizierung und Charakterisierung spezifischer Regulationsprozesse in der Lunge ermöglichen um schließlich neue Therapiemöglichkeiten zu entwickeln. Acute lung injury (ALI) as well as pulmonary diseases like pneumonia and sepsis remain important causes of mortality in intensive care units. The early stage of sepsis is characterized by a massive inflammatory answer, whereas apoptosis of lymphocytes is a sign of late sepsis.Prevalence of acute lung failure is 12.5% of all patients treated in intensive care units for more than 24 hours. Mortality ranges from 40 to 60%.To get a deeper insight into the molecular changes in immune cells during ALI we investigated proteome profiles of spleen lymphocytes of fat-1 and wild-type (C57BL/7) mice after intratracheal instillation of LPS at various time points.Transgenic fat-1 mice encoding n-3 fatty acid desaturase, are capable of converting n-6 polyunsaturated fatty acids to n-3 polyunsaturated fatty acids. The n-3-fatty acid eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) and mediators derived from EPA and DHA possess reduced inflammatory potency.The proteomes of the murine spleen-lymphocytes were analysed before application and at defined times (4, 24 and 72 hours) afterwards.Proteins were separated by 2D-gel electrophoresis and visualized either by DIGE-labeling or Flamingo staining. Densitometric analyses were performed and differentially expressed protein species were identified by MALDI-TOF mass spectrometry.In total we identified 285 differentially expressed proteins: 82 proteins from fat-I mice and 203 from wild-type mice. Interestingly, a higher number of differentially regulated proteins involved in immune reactions were found in fat-1 mice within the first 72 hours after LPS challenge compared to wild-type mice. 30 proteins that had been upregulated after stimulation with LPS were identified from fat-1 mice, 24 from wild-type mice. Expression of 12 proteins from fat-1 mice and of 20 proteins from wild-type mice were downregulated. From wild-type mice, 84 proteins could be identified that were expressed only after LPS-stimulation ( with LPS ), as well as 47 proteins that were expressed only without LPS-stimulation ( without LPS ).From fat-1 mice, 26 proteins could be identified that were expressed only after LPS-stimulation ( with LPS ), as well as 13 proteins that were expressed only without LPS-stimulation ( without LPS ).The identified proteins have a variety of different functions. They are involved in signal transduction, transcription, protein metabolism, immune system, structure, translation or general metabolism, they function as chaperones or their function is unknown.The identified proteins from fat-1 mice are mainly involved in signal transduction and the immune system. Most of the identified proteins of the wild-type mice are chaperones or part of proteasomes. This analysis shows a regulation of protein expression of the spleen-lymphocytes after LPS-stimulation.Intratracheal instillation of LPS generates a defined and reproducible alveolar inflammation. Within 72 hours there is a continuous invasion of leukocytes from blood into the alveolar compartment.After 72 hours first signs of an induction of apoptosis could be found in spleen-lymphocytes. Identification of proteins in fat-1 mice showed a quicker and greater release of immunoglobulins.These proteomic data provide new insights on protein level about the regulation of pulmonary inflammation induced by alveolar deposition of endotoxin and thus allow identification and characterisation of regulatory processes in the lung and eventually the development of new therapies.