Role of megalin in albumin transport across the alveolar epithelium and its dysregulation by transforming growth factor beta

Abstract

The acute respiratory distress syndrome (ARDS) displays mortality rates of up to 40 % in approximately 200,000 critically ill patients in the United States annually. The disease is characterized by accumulation of protein-rich edema in the alveolar space due to impaired endothelial and epithelial barrier function in the lung. Of great importance is the clearance of plasma proteins from the alveolar space. Sodium and fluid is cleared from the lung quite rapidly via active transport processes, leading to increased protein concentration in the alveolar compartment. This increased concentration of protein creates an oncotic gradient which further promotes alveolar edema formation, thereby preventing recovery. Albumin clearance and edema resolution are crucial for the patient s survival. However, the mechanisms by which albumin transport is facilitated have not been fully elucidated. In the present study we used primary alveolar epithelial cells and an intact organ model to investigate the mechanisms of protein clearance from the alveolar space. In tight monolayers of alveolar epithelial type II cells and type I-like cells, transport of 125I-albumin was almost completely blocked by competition with unlabeled albumin. Similar results were obtained by assessing the uptake of FITC-albumin by fluorescence microscopy, indicating that albumin transport is facilitated by an active and receptor-mediated transport process. A number of previous studies have reported that clathrin-dependent endocytosis is the main pathway for protein uptake along epithelia, and the multi-ligand receptors megalin and cubilin have been established to facilitate clathrin-dependent endocytosis of proteins in the kidney. To investigate the role of clathrin-dependent endocytosis and megalin in the physiological significance of albumin transport in the lung, we applied receptor associated protein (RAP), an inhibitor of megalin-mediated endocytosis, to our cell monolayers and detected significantly decreased albumin transport rates. Since pharmacological inhibitors may have non-specific effects on unrelated proteins, we employed a genetic approach to further elucidate the role of megalin in albumin uptake by alveolar epithelial cells. We sought to specifically silence the megalin gene by RNA interference. Since primary ATII cells display very low transfection efficiency, we employed cultured RLE-6TN cells, an established in vitro model system for ATII cells. In these cells, gene silencing of megalin resulted in an almost complete block of albumin uptake. Collectively, our findings suggested that under physiological conditions, albumin endocytosis in the alveolar epithelium was mediated by megalin. Importantly, we observed similar protein transport rates in both alveolar epithelial cell types. These findings are of high significance, since type I pneumocytes represent more than 95% of the alveolar surface area. To determine the mechanisms of albumin transport in the pathophysiology of acute lung injury we applied TGF-beta1, a key mediator of ALI/ARDS, to alveolar epithelial cells and to the isolated, ventilated and perfused rabbit lung and detected significantly impaired albumin transport rates (within 30 minutes in cell monolayers and within 120 minutes in the isolated rabbit lung). Furthermore, we observed markedly decreased megalin membrane abundance in response to a pathologically relevant concentration of TGF-beta1 via immunofluorescence. We found evidence that TGF-beta1 activates both subunits of glycogen synthase kinase 3 (GSK3), a kinase that phosphorylates megalin and thereby induces endocytosis of the receptor. Importantly, maximal activation of GSK3 under TGF-beta1 stimulation was observed within minutes, which was in line with the rapid impairment of albumin transport we detected under TGF-beta1 challenge in primary alveolar epithelial cells and in the isolated rabbit lung. When GSK3 activity was inhibited by administration of the specific inhibitor SB 216763, TGF-beta1-mediated downregulation of megalin membrane expression was prevented and albumin transport remained unaffected. These data implied that TGF-beta1-mediated activation of GSK3 induced phosphorylation and subsequent endocytosis of megalin, thereby disrupting albumin transport in the alveolar epithelium. Since inhibition of GSK3 as a therapeutic strategy has been presumed to be beneficial for several diseases, we set out to investigate a potential role for SB 216763 in the therapy of acute lung injury. Treatment of alveolar epithelial cells with the specific GSK3 inhibitor after TGF-beta1 challenge restored normal megalin surface distribution and albumin transport. These findings may suggest a potential role for GSK3 inhibition as a novel therapeutic approach in ALI/ARDS. Das Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) führt jährlich bei ungefähr 200,000 kritisch erkrankten Patienten zu einer Mortalitätsrate von bis zu 40 %, allein in den USA. Leitsymptom ist die Anreicherung einer proteinreichen Ödemflüssigkeit in den Lungenalveolen. Die Lungeninsuffizienz wird durch eine Schädigung der endothelialen und epithelialen Schranke des Lungenparenchyms verursacht. Aus klinischer Sicht ist vor allem der Abtransport von Plasmaproteinen aus dem Alveolarraum von großer Bedeutung. Da Ionen und Flüssigkeit relativ schnell über aktive Prozesse abtransportiert werden können, erhöht sich die Proteinkonzentration in der Alveole zunehmend. Es entsteht ein onkotischer Druck, der das Lungenödem verschlimmert und eine Heilung verhindert. Der Abtransport von Proteinen und die Auflösung des Ödems sind entscheidend für das Überleben des Patienten, allerdings sind die Mechanismen des Albumintransports noch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Studie wurden primäre Pneumozyten und ein intaktes Organmodel verwendet, um die Mechanismen des Proteintransports im Alveolarraum zu untersuchen. In dichten Monolayern aus Typ II und Typ I Pneumozyten wurde der Transport von 125I-Albumin fast vollständig durch Kompetition mit unmarkiertem Albumin blockiert, ähnliche Ergebnisse lieferten mikroskopische Untersuchungen mit FITC-Albumin. Diese Daten implizieren, dass Albumin über einen aktiven Rezeptor-vermittelten Prozess transportiert wird. In mehreren Studien wurde festgestellt, dass in Epithelien hauptsächlich die Clathrin-abhängige Endozytose die Aufnahme von Makromolekülen, wie Proteinen, bewerkstelligt. In diesem Zusammenhang wurde auch von den Multiliganden Rezeptoren Megalin und Cubilin berichtet, die die Clathrin-abhängige Endozytose von Albumin in der Niere vermitteln. Um die Bedeutung der Megalin-vermittelten und Clathrin-abhängigen Endozytose beim Proteintransport in der Lunge zu untersuchen, behandelten wir Pneumozyten mit Receptor Associated Protein (RAP), einem Inhibitor der Megalin-vermittelten Endozytose, was deutlich die Aufnahme und den Transport von Albumin verminderte. Da Pharmakologische Hemmstoffe mit unspezifischen Nebenwirkungen einhergehen können, setzten wir einen genetischen Ansatz ein um die Bedeutung von Megalin als Albuminrezeptor zu ermitteln. Dazu wurde das Megalin-Gen mittels RNA Interferenz spezifisch ausgeschalten. Wegen ihrer hohen Transfektioneffizienz verwendeten wir kultivierte RLE-6TN Zellen, ein etabliertes in vitro Model für Typ II Pneumozyten. Das Gen-Silencing führte in diesen Zellen zu einer fast vollständigen Blockierung der Albuminaufnahme. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Megalin, unter physiologischen Bedingungen, die Aufnahme von Albumin durch das alveolare Epithel vermittelt. Interessanterweise konnten wir vergleichbare Transportraten in Typ I und Typ II Zellen feststellen, was von besonderer Bedeutung ist, da Typ I Zellen mehr als 95% der alveolaren Oberfläche darstellen. Um den Albumintransport in der Pathophysiologie von ARDS zu untersuchen, applizierten wir Transforming Growth Factor (TGF)-beta1, ein Schlüsselmolekül in der Entstehung von ARDS, in Pneumozyten und in der isolierten, ventilierten und perfundierten Kaninchenlunge. Eine pathologisch relevante Konzentration an TGF-beta1 führte innerhalb kurzer Zeit zu deutlich vermindertem Albumintransport in beiden Modellen. Des Weiteren stellten wir eine verminderte Expression von Megalin in der Plasmamembran fest. Wir fanden Hinweise auf eine Aktivierung beider Untereinheiten der Glykogen Synthase Kinase 3 (GSK3) durch TGF-beta1. Die GSK3 kann Megalin phosphorylieren und dadurch die Endozytose des Rezeptors verursachen. Maximale Aktivierung der GSK3 zeigte sich innerhalb weniger Minuten, was mit unseren vorangegangenen Ergebnissen übereinstimmt, die eine zeitlich gesehen schnelle Störung des Albumintransportes durch TGF-beta1 dokumentieren. Als wir den spezifischen GSK3 Inhibitor SB 216763 applizierten, wurde die TGF-beta1-vermittelte Herabsetzung der Megalinexpression in der Zellmembran verhindert und der Albumintransport blieb unverändert. Diese Daten deuten darauf hin, dass eine TGF-beta1-vermittelte Aktivierung der GSK3 zur Endozytose von Megalin führt, wodurch der alveolare Albumintransport gestört wird. Da die GSK3 Hemmung in verschiedenen Erkrankungen als therapeutische Maßnahme erfolgreich eingesetzt wurde, untersuchten wir eine mögliche Bedeutung in der Therapie von ARDS. Pneumozyten wurden zuerst mit TGF-beta1 stimuliert und anschließend mit SB 216763 behandelt. Diese Behandlung stellte die ursprüngliche Verteilung von Megalin in der Zellmembran und den physiologischen Albumintransport wieder her. Diese Daten könnten auf eine mögliche Bedeutung der GSK Hemmung als neuartige Strategie in der Therapie von ARDS hinweisen.