Einfluss des parathormonähnlichen Peptids (PTHrP) auf den Ca2+ aktivierten Kaliumkanal mit großer Leitfähigkeit und die Calciumhomöostase bei glatten Muskelzellen (VSMC)

Abstract

Das Parathormon ähnliche Peptid (PTHrP) ist ein vasodilatatorisch wirksames Peptid, welches von diversen Zellen des kardiovaskulären Systems produziert und sezerniert wird. Ziel dieser Studie ist es herauszufinden, wie PTHrP (0,5 mumol L 1) glatte Muskelzellen (vascular smooth muscle cells VSMC) beeinflusst, mit besonderem Augenmerk auf die Hyperpolarisation der Zellmembran und die Calciumhomöostase.VSMC werden aus der Rattenaorta isoliert und im weiteren Verlauf kultiviert. Membranpotentialänderungen werden mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffes bis-1,3-dibutylbarbituric acid-trimethine oxonol (DiBAC (0,5 µmol L 1), Molecular Probes, Leiden, Niederlande) ermittelt. Durch Fura-2-acetoxymethylester (AM) (2,5 mumol L 1) Imaging werden Veränderungen der Ca2+-Freisetzung determiniert. PTHrP (0,01-1,0 mumol L 1) verursacht einen konzentrationsabhängigen Abfall der DiBAC (0,5 µmol L 1) Fluoreszenz Intensität mit einem maximalen Effekt bei 0,5 µmol L-1. Dieser Abfall demonstriert, dass PTHrP eine Hyperpolarisation der VSMC induziert. Der Effekt kann durch die Präsenz von Iberiotoxin (100 nmol L 1), einem hochselektiven Inhibitor des calciumaktivierten Kaliumkanals mit großer Leitfähigkeit (BKCa), blockiert werden. Desweiteren reduziert der Ca2+-chelator BAPTA (10 mumol L 1) die durch PTHrP (0,5 mumol L 1) hervorgerufene Hyperpolarisation signifikant.Auch Xestospongin D (6 mumol L 1), ein Inhibitor der IP3 gesteuerten Calciumfreisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum, hemmt die Membranhyperpolarisation der glatten Muskelzellen durch PTHrP signifikant.PTHrP (0,5 mumol L 1) ruft ebenfalls einen Abfall des Fura-2-AM (2,5 mu;mol L 1) hervor, welches ein Indikator der intrazellulären Ca2+ -Konzentration ist. Dieser Effekt wird ebenfalls durch Iberiotoxin (100 nmol L 1) blockiert. Xestospongin C (3 mumol L 1) und Xestospongin D (6 mumol L 1), beides Inhibitoren der IP3-getriggerten Ca2+ Freisetzung, verhindern die Wirkung des PTHrP (0,5 mumol L 1). Des Weiteren wird noch von Tapsigargin (1 µmol L 1), einem Hemmstoff der Kalziumpumpe des endo/sarkoplasmatischen Retikulums, Gebrauch gemacht. Thapsigargin vermindert dabei ebenfalls den Effekt des PTHrP (0,5 mumol L 1) signifikant.Zusammenfassend geht aus den vorliegenden Daten hervor, dass es durch PTHrP (0,5 mu;mol L 1) mittels Aktivierung des BKCa zu einer Hyperpolarisation der VSMC kommt. Diese Ionenkanalaktivierung ist dabei Ca2+-abhängig. Hinzu kommt, dass diese Aktivierung von der IP3-getriggerten Ca2+-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum beeinflusst wird. Parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) is a vasodilator peptide, produced and secreted by various cells of the cardiovascular system. Its vasorelaxing effect is independent of the presence of nitric oxide. The aim of the present study is to examine how PTHrP (0,5 mumol L 1) affects vascular smooth muscle cells (VSMC) with a special interest on the hyperpolarization of the membrane. VSMC are isolated from rat aorta and further subcultured. Changes of the membrane potential are examined using the fluorescence dye bis-1.3-dibutylbarbituric acid-trimethine oxonol (DiBAC (0,5 µmol L 1), Molecular Probes, Leiden, Netherlands). Fura-2-acetoxymethylester (AM) (2,5 mumol L 1) imaging is used to determine changes in the Ca2+ release of the VSMC. PTHrP (0,01-1,0 mumol L 1) causes a concentration-dependent decrease of DiBAC (0,5 µmol L 1) fluorescence intensity with a maximum effect at 0,5 µmol L-1. This decrease demonstrates the PTHrP induced hyperpolarization of the VSMC. The effect is blocked in the presence of iberiotoxin (100 nmol L 1), which is a highly selective inhibitor of large conductance Ca2+-activated K+ channels (BKCa). Furthermore, the Ca2+ chelator BAPTA (10 mumol L 1) significantly reduces PTHrP (0,5 mumol L 1) induced hyperpolarization. PTHrP (0,5 mumol L 1) also causes a decrease of the fluorescence intensity of the indicator for intracellular Ca2+: Fura-2-AM (2,5mumol L 1). The effect is blocked again by iberiotoxin (100 nmol L 1). Xestospongin C (3 mumol L 1) and Xestospongin D (6 mumol L 1), both inhibitors of the IP3-triggered Ca2+ release, impede the effect of PTHrP (0,5 mumol L 1). Additionally Tapsigargin (1 µmol L 1), a blocker of the endo/sarcoplasmic reticulum calcium pump is used. Tapsigargin also inhibits the effect of PTHrP (0,5 mumol L 1).In conclusion, the results of the present study demonstrate that PTHrP (0,5 mumol L 1) induces hyperpolarization in VSMC. It activates BKCa in VSMC. This ion channel activation is Ca2+ dependent. The activation is linked to the IP3-triggered Ca2+ release and is also dependent on the endo/sarcoplasmic reticulum calcium pump. Key words: smooth muscle cells, Ca2+-activated K+ channel, calcium, PTHrP, hyperpolarization