Role of CPI-17 in ischemia-reperfusion induced barrier failure

Abstract

Failure of endothelial barrier leading to capillary leakage and edema formation during reperfusion represents major impediment for the recovery of an organ. The endothelial barrier function is maintained by equilibrium of competing contractile and adhesive forces, generated by the actomyosin cytoskeleton and adherens junction proteins, respectively. The activity of the endothelial contractile machinery is regulated by the phosphorylation state of the myosin light chain (MLC), the activity of which is regulated by activities of MLC-kinase (MLCK) and MLC-phosphatase (MLCP). In the present study, the molecular mechanism of ischemia-reperfusion-induced activation of the contractile machinery was analyzed, focusing on the involvement of protein kinase C (PKC) and Rho-associated kinase (ROCK)-mediated inhibition of MLCP. Furthermore, rearrangement of the actin cytoskeleton, loss of VE-cadherin, and ß-catenin from cell-cell adhesions were analyzed during ischemia-reperfusion. Exposure of endothelial cells to severe ischemia (Po2 < 1 mmHg, pH 6.4) for 45 min, followed by 45 min of reperfusion, caused an increase in macromolecule permeability and phosphorylation of MLC, myosin-targeting subunit of MLCP (MYPT1), and C-kinase potentiated protein phosphatase-1 inhibitor (CPI-17). ML-7 (10 µM), a pharmacological inhibitor of MLCK, partially reduced ischemia-reperfusion-induced MLC phosphorylation and hyperpermeability. But also PKC inhibitor bisindolylmaleimide (8 µM) and Rho kinase inhibitor Y-27632 (20 µM) reduced ischemia-reperfusion-induced barrier dysfunction and phosphorylation of MLC, MYPT1, and CPI-17. Downregulation of CPI-17 by siRNA significantly abolished the ischemia-reperfusion-induced increase in permeability and led to actin cytoskeleton rearrangement and restoration of VE-cadherin at cell-cell adhesions.The data of the present study show for the first time that under ischemia-reperfusion CPI-17 is activated, it stimulates the contractile machinery and induces distortion of adherens junction proteins. These effects are prevented by downregulation of CPI-17. The development of therapeutic strategies targeting CPI-17 provides a new option to protect against ischemia-reperfusion-induced barrier failure. Das Versagen der endothelialen Schranke führt zur kapillären Leckage und Ödembildung und ist ein Haupthindernis bei der Wiedererholung der Organfunktion im Verlauf der Reperfusion. Die endotheliale Barrierenfunktion wird durch das Gleichgewicht zweier konkurrierender Kräfte aufrechterhalten: den kontraktilen Kräften, vermittelt über das Actomyosin-Zytoskelett und den Haltekräften, vermittelt über Adherens Junctions. Die Aktivität des endothelialen kontraktilen Apparates wird über Phosphorylierung der Myosinleichtketten (MLC) reguliert, welche wiederum durch die Aktivitäten von MLC-Kinase (MLCK) und MLC-Phosphatase kontrolliert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde der molekulare Mechanismus der Ischämie-Reperfusion-induzierten Aktivierung des kontraktilen Apparates analysiert. Dabei lag der Schwerpunkt der Arbeit auf der Proteinkinase C (PKC)- und Rho-abhängigen Kinase (ROCK)-vermittelten Hemmung der MLKP. Darüber hinaus wurden Änderungen des Aktin-Zytoskeletts, die Translokation von VE-Cadherin und ß-Catenin aus den Zell-Zell-Adhäsionsstrukturen während Ischämie-Reperfusion untersucht. Eine Ischämie (Po2 < 1 mmHg, pH 6,4) für 45 min, gefolgt von einer 45-minütigen Reperfusion, verursachte einen Anstieg der Makromolekülpermeabilität und Phosphorylierung der MLC, Myosin-bindender Untereinheit der MLCP (MYPT1) und dem C-kinase potentiated protein phosphatase-1 inhibitor (CPI-17). ML-7 (10 µM), ein pharmakologischer Inhibitor der MLCK, reduzierte die Ischämie-Reperfusion-induzierte MLC-Phosphorylierung und Hyperpermeabilität teilweise. Der PKC-Inhibitor Bisindolylmaleimid (8 uM) und Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 (20 µM) reduzierte die Ischämie-Reperfusion-induzierte Schrankenstörung und Phosphorylierung von MLC, MYPT1 und CPI-17. Herunterregulation von CPI-17 durch siRNA verminderte die Ischämie-Reperfusion-induzierte Steigerung der Permeabilität und bewirkte die Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts und von VE-Cadherin an den Zell-Zell Kontakten.Die Daten der vorliegenden Studie zeigen zum ersten Mal, dass unter Bedingungen einer Ischämie-Reperfusion CPI-17 aktiviert wird, welches den kontraktilen Apparat stimuliert und zur Störung der Adherens junctions beiträgt. Diese Wirkung kann durch Herunterregulieren von CPI-17 verhindert werden. Die Entwicklung von therapeutischen Strategien, die auf CPI-17 abzielen, stellt eine neuartige Option dar, um vor dem Ischämie-Reperfusion-induzierten Schrankenversagen zu schützen.