S-nitrosation of mitochondrial Connexin 43 regulates mitochondrial function: implication for cardioprotection

Abstract

S-nitrosation of connexin 43 formed channels alters dye uptake in astrocytes and gap junctional communication in endothelial cells. Apart from forming channels in the cell surface membrane of several cell types, connexin 43 is also located at the inner membrane of myocardial subsarcolemmal mitochondria, but not in interfibrillar mitochondria. The absence or pharmacological blockade of mitochondrial connexin 43 decreases mitochondrial dye and potassium uptake. A lack of mitochondrial connexin 43 is associated with the loss of cardioprotection by ischemic preconditioning, which is mediated by formation of reactive oxygen species. Whether or not mitochondrial Lucifer Yellow, ion uptake, or reactive oxygen generation are affected by S-nitrosation of mitochondrial connexin 43 and whether or not cardioprotective interventions influence S-nitrosation of mitochondrial connexin 43 remains unknown.Subsarcolemmal mitochondria from rat hearts showed an increased Lucifer Yellow uptake in response to nitric oxide donors (S-nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine (SNAP): 38.4 ± 7.1%, p<0.05; S-nitrosoglutathione (GSNO): 28.1 ± 7.4%, p<0.05) and an increased refilling rate of potassium (SNAP: 227.9 ± 30.1%, p<0.05; GSNO: 122.6 ± 28.1%, p<0.05). These effects were abolished following blockade of connexin 43 hemichannel by carbenoxolone as well as in interfibrillar mitochondria, which lack connexin 43. Unlike potassium, the sodium permeability was not affected by application of nitric oxide. Furthermore, mitochondrial reactive oxygen species formation was enhanced in response to nitric oxide application compared to control treatment group (SNAP: 22.9 ± 1.8%, p<0.05; GSNO: 40.6 ± 7.1%, p<0.05), but decreased following nitric oxide treatment in interfibrillar mitochondria compared to control treated interfibrillar mitochondria (SNAP: 14.4 ± 4%, p<0.05; GSNO: 13.8 ± 4%, p<0.05). Administration of nitric oxide donors to isolated subsarcolemmal mitochondria or nitrite application into the cavity of left ventricles in mice in vivo enhanced S-nitrosation of mitochondrial connexin 43 by 109.2 ± 15.8% and by 59.3 ± 18.2%, respectively (p<0.05). Ischemic preconditioning by 4 cycles of ischemia and reperfusion, enhanced S-nitrosation of mitochondrial connexin 43 by 41.6 ± 1.7% (p<0.05) in comparison to subsarcolemmal mitochondria from control perfused rat hearts. These data suggest that S-nitrosation of mitochondrial connexin 43 increases mitochondrial permeability, especially for potassium and leads to increased formation of reactive oxygen species. The increased amount of S-nitrosated mitochondrial connexin 43 by ischemic preconditioning or nitrite administration may link nitric oxide and connexin 43 in the signal transduction cascade of cardioprotection by preconditioning. Neben der Bildung von transmembranen Kanälen an der Zelloberfläche, ist Connexin 43 auch in der inneren Membran von subsarkolemmalen Mitochondrien lokalisiert. In interfibrillären Mitochondrien ist Connexin 43 jedoch nicht nachweisbar. Die Abwesenheit oder pharmakologische Inhibierung von mitochondrialem Connexin 43 verringert die mitochondriale Farbstoff- und Kaliumaufnahme und führt zum Verlust von Kardioprotektion durch ischämische Präkonditionierung, welche durch die moderate Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies ausgelöst wird. Die S-Nitrosierung von Connexin 43 gebildeten Membrankanälen führt zu einer veränderten Farbstoffaufnahme in Astrozyten und beeinflusst die auf Gap Junctions basierende Kommunikation zwischen den Zellen des Endothels. Gegenstand der vorliegenden Untersuchung ist die Analyse der S-Nitrosierung von mitochondrialem Connexin 43 und dessen Einfluss auf die mitochondriale Farbstoffaufnahme, mitochondriale Ioneneinströme, und Formierung reaktiver Sauerstoffspezies. Zusätzlich wurde die S-Nitrosierung vom mitochondrialem Connexin 43 nach kardioprotektiven Interventionen quantifiziert. In subsarkolemmalen Mitochondrien von Rattenherzen, die mit den Stickstoffmonoxid-Donatoren S-nitrosoglutathione (GSNO) und S-nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine (SNAP) behandelt wurden, war die Lucifer Yellow Farbstoffaufnahme (SNAP: 38.4 ± 7.1%, p<0.05; GSNO: 28.1 ± 7.4%, p<0.05) und die Geschwindigkeit des Kaliumstroms erhöht (SNAP: 227.9 ± 30.1%, p<0.05; GSNO: 122.6 ± 28.1%, p<0.05). Die Wirkung der Stickstoffmonoxid-Donatoren wurde durch Inhibierung der Connexin 43 Hemikanäle aufgehoben und war in interfibrilären Mitochondrien, die kein Connexin 43 enthalten, nicht nachweisbar. Im Gegensatz zu Kalium, war die Natrium-Permeabilität durch die Verabreichung von Stickstoffmonoxid nicht beeinflussbar. Außerdem wurde die mitochondriale Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies durch die Zugabe von Sticksfoffmonoxid-Donatoren (SNAP und GSNO) in subsarkolemmalen Mitochondrien gesteigert (SNAP: 22.9 ± 1.8%, p<0.05; GSNO: 40.6 ± 7.1%, p<0.05). Im Gegensatz dazu führte die Zugabe von Stickstoffmonoxid in interfibrillären Mitochondrien zu einer Reduktion der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (SNAP: 14.4 ± 4%, p<0.05; GSNO: 13.8 ± 4%, p<0.05). Die Verabreichung von Stickstoffmonoxid-Donatoren oder die Injektion von Nitrit in den linken Ventrikel von Mäusen in vivo führte zu einer Erhöhung der S-Nitrosierung von Connexin 43 in subsarkolemmalen Mitochondrien um 109.2 ± 15.8% bzw. 59.3 ± 18.2%, (p<0.05). Ischämische Präkonditionierung, hervorgerufen durch vier Zyklen von Ischämie und Reperfusion, erhöhte die S-Nitrosierung vom mitochondrialem Connexin 43 um 41.6 ± 1.7% (p<0.05) im Vergleich zu subsarkolemmalen Mitochondrien von kontroll-perfundierten Rattenherzen.Die im Rahmen dieser Arbeit erfassten Daten zeigen, dass S-Nitrosierung von mitochondrialem Connexin 43 die mitochondriale Permeabilität für Farbstoff und besonders für Kalium-Ionen erhöht. Die S-Nitrosierung von mitochondrialem Connexin 43 führt zu einer erhöhten Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies. Ischämische Präkonditionierung als auch die der Verabreichung von Nitrit führte zu einer erhöhten Menge an S-nitrosiertem mitochondrialen Connexin 43. Schlussfolgernd liegt es nahe, dass die S-Nitrosierung von mitochondrialem Connexin 43 für die Vermittlung des kardioprotektiven Signals von Bedeutung ist.