Untersuchung der Veränderungen des Lungenproteoms mittels pulsed-SILAC Markierung bei experimenteller Pulmonaler Hypertonie mit Tyrosinkinase-Inhibitor Therapie

Abstract

Pulmonale Hypertonie (PH) ist eine progressive verlaufende Erkrankung, die durch einen erhöhten pulmonalarteriellen Druck charakterisiert ist. In den Pulmonalarterien kommt es zur Vasokonstriktion und zu Umbauprozessen der Gefäßwände, dem sogenannten Remodeling. Diese Prozesse führen zur Verringerung des Gefäßlumens und zusammen mit der Vasokonstriktion zur progressiven Zunahme des pulmonalvaskulären Widerstandes. Der rechte Ventrikel kann diese gesteigerte Nachlast zunächst kompensieren, im Verlauf der Erkrankung kommt es aber zum Rechtsherzversagen.Es sind viele Signalwege bekannt, die in der PH eine Rolle spielen, dennoch ist diese Erkrankung bis heute nicht heilbar. Bisher zugelassene Therapien führen zur Vasodilatation und verringern darüber die Nachlast auf den rechten Ventrikel. Neue Therapieansätze zielen darauf ab, das Remodeling aufzuhalten oder sogar umzukehren (reverse Remodeling). Der Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib hat hierbei gute Erfolge im Tiermodell und klinischen Studien gezeigt.In der vorliegenden Arbeit wurde ein nicht-hypothesengelenkter Ansatz gewählt, um neue, bisher nicht beschriebene Signalwege der PH zu identifizieren. Es wurde das Rattenmodell der Monocrotalin (MCT)-induzierten PH verwendet, das gut die Remodeling-Prozesse der humanen PH abbildet und in dem die Wirksamkeit von Imatinib beim reverse Remodeling bereits gezeigt ist. Um die Veränderungen im Lungen-Proteom der Ratten untersuchen zu können, wurden die Tiere mit stabilen Isotopen markiert (stable isotope labeling of amino acids in cell culture, SILAC). Die Tiere wurden mit SILAC-Futter gefüttert, das schweres 13C6-Lysin enthält, in dem jedes 12C-Atom durch das stabile aber schwerere Isotop 13C ersetzt wurde. Die spezifische Massendifferenz zwischen dem schweren und dem leichten Lysin ermöglicht die Quantifizierung der im Massenspektrometer identifizierten Proteine. Die drei Gruppen Kontrolle, MCT/Placebo und MCT/Imatinib wurden für zwei Wochen mit dem SILAC-Futter gefüttert. Die Listen der identifizierten Proteine mit den 13C6-Lysin Einbauraten wurden mittels t-Test verglichen und eine Analyse zur Veränderung von GO-Termen durchgeführt.Bei den GO-Termen zeigen sich strukturelle Veränderungen der Zellkompartimente Membran, Vesikel und Zellverbindung, sowie Veränderungen bei Prozessen der Zelladhäsion für den Vergleich der Placebo- zur Kontroll-Gruppe. Beim Vergleich der Imatinib- zur Placebo-Gruppe sind katabole Stoffwechselprozesse hoch signifikant verändert.Der Vergleich der 13C6-Lysin-Inkorporation in einzelne Proteine mittels t-Test ergibt 19 hoch signifikant veränderte Proteine in der Placebo-Gruppe im Vergleich zur Kontroll-Gruppe, und 13 hoch signifikante veränderte Proteine in der Imatinib-Gruppe verglichen zur Placebo-Gruppe. Aus diesen wurden fünf Kandidaten ausgewählt und mittels Western Blot und immunhistochemischen Färbungen in Lungen von gesunden und MCT-Ratten nachgewiesen.Die Kandidaten Dysferlin, Emilin-1, HIP1, Septin-7 und Villin wurden mit dem nicht-hypothesengelenkten SILAC-Ansatz identifiziert und mit Antikörper-basierten Methoden nachgewiesen. Alle fünf Proteine sind bisher nicht im Zusammenhang mit PH beschrieben, sind aber in Pathomechanismen involviert, die auch in der PH beschrieben sind. In weiteren Studien kann jetzt die Rolle dieser Proteine in der humanen PH untersucht werden. Pulmonary hypertension (PH) is a progressive disease characterized by increased pulmonary arterial pressure. Pathological changes like vasoconstriction and vascular remodeling lead to a narrowing of the luminal diameter and an increase in pulmonary vascular resistance. The increased afterload is compensated by right ventricular hypertrophy, but during disease progression patients develop right heart failure.Today many different pathways are known to be involved in PH pathogenesis, but PH is still an incurable disease. Approved therapies target the vasoconstriction and lower the afterload, new therapeutic strategies aim to stop or reverse the remodeling processes in the pulmonary vasculature. Imatinib is a receptor tyrosine-kinase inhibitor that has shown its efficiency in reverse remodeling in animal models and clinical studies.The aim of this study was to identify unknown pathways and proteins involved in PH. A non-hypothesis driven high-throughput proteomic approach was chosen to investigate proteomic changes in an animal model of PH. The monocrotaline (MCT)-induced rat PH model was used because it mirrors best the remodeling processes of human PH, and Imatinib was already shown to be efficient in reverse remodeling in this model. To investigate the lung proteome changes, we metabolically labeled the rats by stable isotope labeling of amino acids in cell culture (SILAC). The rats received SILAC-food that contains a heavy lysine. By replacing the normal 12C carbon atom with the heavy stable isotope 13C the mass of the amino acid is increased and this specific mass difference allows for quantitative comparison of the lung proteomes.Three groups, a control group, a MCT/placebo group and a MCT/Imatinib group were fed with SILAC-food for two weeks. The lists with the identified proteins with 13C6-lysine incorporation were compared by t-test and analyses of GO-term changes were performed.Changes in GO-terms were detected for cellular components membrane, vesicles and cell junctions. For biological processes changes in cell adhesion were detected for the comparison of the placebo vs. the control group. For the comparison of the Imatinib vs. the placebo group significant changes were only detected in organic and carboxylic acid catabolic processes.By comparing 13C6-lysine incorporations into single proteins by t-test 19 proteins were identified to be significantly changed in placebo vs. control group, and 13 proteins in the Imatinib vs. placebo group. Out of these, five candidates were picked to be further evaluated. The expression of these five candidates in healthy and MCT rat lungs was confirmed by Western Blot und localized by immunohistochemistry.With the non-hypothesis driven pulsed-SILAC approach dysferlin, emilin-1, HIP1, septin-7 and villin were identified and additionally confirmed by antibody-based methods. These five proteins are not described in the pathology of PH but the results of this study, together with published data for these proteins, led to hypotheses of their roles in PH. Further studies are needed to confirm their role in human PH and investigate in which way they interact in disease pathways.