Zoonotisches Potenzial neu entdeckter Orthohepadnaviren aus Fledermäusen und die Charakterisierung der Virus-Rezeptor Interaktionen des Hepatitis B Virus

Abstract

Das Hepatitis-B-Virus (HBV) des Menschen ist der Erreger der Hepatitis B und ein Vertreter der viralen Familie der Hepadnaviridae, die sich durch einen engen Wirts- und Organtropismus auszeichnet. Die Avihepadnaviren infizieren jeweils einzelne Vogelarten, während die Orthohepadnaviren ihre Wirte innerhalb der Säugetiere haben. Erst 2013 wurden weitere Orthohepadnavirusarten entdeckt, nun überraschenderweise in verschiedenen Spezies der Säugetierordnung Chiroptera (Fledertiere). Dazu gehören die drei hier beschriebenen Fledermaus (engl. Bat)-Orthohepadnaviren (BATHBV), der Wirtstierarten tent making bats TBHBV, horseshoe bats HBHBV, roundleaf bats RBHBV und das LBHBV der long-fingered bat. Phylogenetisch gruppieren die BATHBVs zwischen den Viren der Nagetiere (Rodentia) und der Primaten und Menschen. Insbesondere die Gesamtgenom-Sequenz des BATHBV der als tent-making bat bezeichneten Neuwelt-Fledermaus, Uroderma bilobatum, (TBHBV) ist am engsten mit dem WMHBV des Neuwelt Wollaffen und den humanen HBV Genotypen (F und H) aus Mittel- und Südamerika verwandt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich diese phylogenetischen Verhältnisse auch im zoonotischen Potenzial der Viren widerspiegeln. Während intermediäre und späte Schritte (Proteinexpression, Genom-Replikation, Sekretion) im hepadnaviralen Replikationszyklus von allen BATHBV in humanen Hepatozytenkulturen mit ähnlicher Effizienz stattfinden, konnten wesentliche Unterschiede innerhalb der frühen Infektionsschritte festgestellt werden. Eine HBV-Infektion von primären Hepatozyten konnte durch Vorbehandlung mit viralen myristoylierten präS1-analogen Peptiden (Myr-präS1-Peptiden) mit der AS-Sequenz der entsprechenden Virusarten aus verschiedenen Wirtsorganismen inhibiert werden. Während die Myr-präS1-Peptide der Primaten-HBVs (HBV und WMHBV) sowie des TBHBV bei einer ähnlich niedrigen Konzentration (IC50: < 4 nM) eine HBV-Infektion von primären humanen Hepatozyten inhibieren, war die IC50 der Myr-präS1-Peptide des HBHBV und RBHBV um das 57- bzw. 41-fache höher. In Infektionsexperimenten mit Hepatitis-Delta-Viruskonstrukten, die mit den Oberflächenproteinen von HBV, TBHBV, HBHBV und RBHBV pseudotypisiert (d. h. umhüllt) waren, ermöglichten nur die Oberflächenproteine des TBHBV, nicht aber die von HBHBV und RBHBV, eine Infektion von HBV-suszeptiblen Zellen. Daher geht von TBHBV mutmaßlich eine zoonotische Gefährdung aus. Die Myr-präS1-Peptide des HBHBV und RBHBV zeigten zwar eine schwache Bindung an humane Hepatozyten und bewirkten bei hohen Konzentrationen eine Inhibition der HBV-Infektion; anhand der hier verwendeten in vitro Infektionssysteme konnte aber kein zoonotisches Potenzial dieser Viren festgestellt werden.Der Leber-spezifische Gallensalztransporter NTCP (SLC10A1) wurde in 2012 als ein funktioneller Rezeptor für HBV und HDV identifiziert. Die Expression des NTCP verschwindet wenige Tage nach Explantation der primären Hepatozyten und fehlt bei Hepatomzellen (z.B. HepG2) ganz. Jedoch können Hepatomzellen mit einem Expressionsvektor für NTCP transfiziert werden und sind dann infizierbar. Im humanen NTCP sind die AS 157-165 sowie 84-87 essenziell für eine HBV- und HDV- Infektion. Auf der viralen Seite sind die 48 N-terminalen AS der präS1-Domäne des großen HBV-Oberflächenproteins sowie deren N-terminale Myristoylierung und besonders die AS 9-15 der präS1-Domäne für die HBV-Bindung und für eine erfolgreichen Infektion von Hepatozyten essenziell. In der hier vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die dem NTCP auf Sequenz-, Struktur- und Funktionsebene sehr ähnlichen Transporter der SLC10 Familie (der Ileum spezifische ASBT bzw. SLC10A2, und der Gonaden-spezifischen SOAT bzw. SLC10A6) keine HBV-Suszeptibilität in Hepatomzellen vermitteln. Auch eine Integration der oben beschriebenenen HBV-infektionsrelevanten NTCP-AS-Sequenzen 157-165 sowie 84-87 in die entsprechende Position des ASBT und SOAT bewirkten keine Myr-präS1-Peptidbindung oder HBV-Suszeptibilität. So scheint neben der Speziespezifität auch die Gewebespezifität des HBV durch den NTCP mitbestimmt zu werden. Interessanterweise konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass die natürliche Funktion des NTCP als Gallensalztransporter mit der Fähigkeit korreliert, das Myr-präS1-Peptid des HBV zu binden. Dies zeigte sich darin, dass ein Überschuss an Gallensalzen konzentrationsabhängig die Bindung des Myr-präS1-Peptids an den NTCP inhibierte. Umgekehrt behindert die Myr-präS1-Peptid-Bindung den NTCP-spezifischen Gallensalztransport von Hepatozyten. Außerdem wurde gezeigt, dass Natriumionen, die für den Gallensalztransport des NTCP benötigt werden, auch für die Infektion des HBV notwendig sind. Die genauen molekularen Interaktionen, die während der Bindung zwischen der HBV Myr-präS1-Domäne und dem NTCP stattfinden und zu einer Aufnahme des Virus in die Zelle führen, sind noch unbekannt. In dieser Studie konnte jedoch durch konfokale Laser Scanning Mikroskopie erstmals gezeigt werden, dass ein Fluorophor-konjugiertes Myr-präS1-Peptid (2-48) des HBV bei <10°C spezifisch an NTCP-haltige Membranbereiche von lebenden HepG2-Zellen bindet und dass bei 37°C das Myr-präS1-Peptid zusammen mit dem NTCP langsam innerhalb von 30-60 Min in die Zelle aufgenommen wird. Diese Ergebnisse deuten an, dass das Virus komplexiert mit einem oder mehreren NTCP-Molekülen endozytiert wird. The human hepatitis B virus (HBV) is the infectious agent of hepatitis B and represents the prototype of the viral family of Hepadnaviridae that is characterized by a narrow host- and organ specificity. Within this family, the Avihepadnaviruses infect specific species of birds, while mammals are the host reservoir for the Orthohepadnaviruses. In 2013, four new members of Orthohepadnaviruses have been discovered in four different species of the mammalian order of Chiroptera (bats). The BATHBVs belong to their hosts Tent making Bat TBHBV, Horseshoe Bat HBHBV, Roundleaf Bat RBHBV and Long-fingered Bat LBHBV. Phylogenetic analyses have shown that the BATHBVs cluster between the Orthohepadnaviruses of the rodents and the human and non-human primates. The highest genomic homology was found between TBHBV of the New World tent-making bat Uroderma bilibatum and the WMHBV of the New World non-human primate Woolly Monkey (Lagothrix lagotricha) and human HBV genotypes (F and H) prevailing in Central and South America. In this thesis, a correlation of these phylogenetic characteristics and the zoonotic potential of BHBV was found. While intermediate as well as late replication steps of all BatHBV and HBV take place with similar efficiency in human hepatocytes, clear differences in preS1-domain-dependent early steps of infection could be observed. First, the inhibitory potential of myristoylated (myr-)preS1-peptides derived from the N-terminal domain of the surface proteins of the respective hepadnaviruses on HBV infection was tested. While peptides of the primate HBV and WMHBV and the new world bat TBHBV inhibited HBV-infection of PHH in similar low nanomolar concentrations (IC50: < 4 nM), the IC50 of myr-preS1-peptides the old world bats (HBHBV and RBHBV) showed a 57 and 41 fold increase. In infection experiments with HDV, pseudotyped (i. e. enveloped) with surface proteins of HBV, TBHBV, HBHBV or RBHBV, only pseudotyping with surface proteins of HBV as well as TBHBV but not of the HBHBV or RBHBV could mediate HDV-infection of HBV-susceptible cells. Thus, the TBHBV should be considered as a zoonotic animal hepadnavirus. Although the myr-preS1-peptides of HBHBV and RBHBV weakly bound to membranes of susceptible hepatocytes and cause inhibition of HBV-infection at high concentrations, a zoonotic hazard by these viruses could not be shown by direct infectivity of HBV-susceptible cell cultures.The liver specific bile salt transporter NTCP (SLC10A1) was characterized as a functional receptor for infection of HBV and HDV in 2012. Expression of NTCP declines during several days after plating of primary hepatocytes, while hepatoma cells (i. e. HepG2) show no NTCP-expression at all. A Plasmid-driven expression of NTCP in HepG2 rendered susceptibility for HBV and HDV. The AA positions 157-165 as well as 84-87 of human NTCP have been proven to be essential for HBV- and HDV-infection by. Mandatory for receptor binding and productive infection of hepatocytes are the HBV N-terminal 48 AA of the preS1-domain and especially AA 9-15 as well as the N-terminal myristoylation. The results of this thesis show that also the closest NTCP-relatives of the SLC10 transporter family (ASBT, SLC10A2, located at the apical membrane of enterocytes in the ileum and SOAT, SLC10A6, mainly expressed in pancreas and reproductive organs) with high similarities in sequence, structure and function are not able to mediate HBV-infection after artificial expression in hepatocytes. Even integration of the HBV-infection relevant NTCP-domains (AA 157-165 and 84-87) into appropriate positions of ASBT and SOAT showed no effect on myr-preS1-peptide binding or HBV-susceptibility. This led to the conclusion that in addition to the species specificity, the tissue specificity of HBV might also be mainly determined by NTCP. Interestingly, this study demonstrate that the bile salt transport function of the NTCP correlates with the ability to bind myr-preS1-peptides of HBV. An incubation of the cells with bile salts in excess inhibits myr-preS1-peptide binding to the NTCP in a concentration dependent manner. Vice versa, the binding of HBV myr-preS1-peptide blocks the NTCP-specific bile salt transport into hepatocytes. Furthermore, sodium ions, which are essential for bile salt transport by NTCP, are also essential for HBV infection. Until now, detailed informations about molecular interactions between NTCP and myr-preS1-domain of HBV leading to high affinity binding and subsequent productive uptake of viral particles into the cell are unknown. However, using confocal laser scanning microsopy a specific binding of a fluorophore-coupled myr-preS1-peptide to NTCP enriched membrane domains of living HepG2-cells (< 10°C) followed by a slow uptake of myr-preS1-peptide with NTCP colocalized in cytoplasmatic vesicles (30-60 min 37 °C) could be observed for the first time in this thesis. These results might indicate that endocytosis of HBV requires complexation of the virus with one ore more NTCP-molecules.