Immunhistochemische Analyse der späten Stadien der Spermatogenese zur Klassifikation infertiler Patienten

Abstract

Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Charakterisierung der späten Stadien der Spermatogenese bei infertilen Männern, mit dem Ziel diese genauer klassifizieren zu können. Aus diesem Grund wurden immunhistochemische Untersuchungen mit verschiedenen Antikörpern an den drei Spezies Ratte, Maus und Mensch durchgeführt, um diese auf ihre Verwendbarkeit als stadienspezifische Marker zu testen. Getestet wurden die Antikörper gegen UTF-1 und den Androgenrezeptor (beide in der Arbeit von Herrn M. Wolter nachzulesen) sowie H3Ser10-P, Smad3, CREM-1 und einige Antikörper aus der Gruppe der Histone. UTF-1 war dabei als Marker für die spermatogonialen Stammzellen, der Androgenrezeptor für die Spermatogonien, Smad3 für die Spermatozyten, H3Ser10-P für die meiotischen Teilungen und CREM-1 für die runden Spermatiden geeignet.In der Literatur war bis dahin kein Vergleich zwischen den Lokalisationen der Proteine der Histon-Gruppe der drei Spezies Ratte, Maus und Mensch zu finden. Die Ergebnisse konnten zudem im Rahmen der Histon-Code-Hypothese interpretiert werden und unterstützten die Hypothese: So waren die methylierten Histone in den Stadien der Zellteilung vermehrt exprimiert (Spermatogonien und Spermatozyten) und die Histone während der DNA-Replikation und Genexpression in den Spermatogonien und elongierten Spermatiden acetyliert. Im Gegensatz zu den anderen Antikörpern zeigten sich diese aber nicht als Marker für distinkte Keimzellstadien geeignet. Die als Marker fungierenden Antikörper wurden in einem nächsten Schritt an humanen Hodenbiopsien verschiedener histologischer Klassifikationen angewandt: insgesamt 33 Biopsien mit normaler Spermatogenese, 33 Biopsien mit Spermatozytenarrest und 44 Biopsien mit Hypospermatogenese (durchgeführt wurden diese HYP-Analysen von M. Wolter). Die Auswertung erfolgte durch die Auszählung von je mindestens zehn querangeschnittenen Tubuli pro Biopsie. Der Vergleich der Zellzahlen zeigte signifikante Abnahmen zwischen den Patientengruppen NSP und SZA bei allen Keimzellstadien und zwischen HYP und SZA ebenfalls in allen Stadien. Zwischen NSP und HYP war nur die Abnahme der Spermatogonien und Spermatozyten statistisch signifikant. Es wurde keine Korrelation zum Alter der Patienten oder der Obstruktion der Samenwege gefunden. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit und der Doktorarbeit von Herrn M. Wolter wurde ein neues Klassifikationssystem für infertile Patienten entwickelt. Es fasst die Zellzahlen der spermatogonialen Stammzellen, der Spermatogonien und der Sertoli-Zellen zur Gruppe des Stammzellpools zusammen und die Zellzahlen der Spermatozyten, meiotischen Teilungen und runden Spermatiden bilden die Gruppe der meiotischen Defekte. Als Defekt wurde eine Zellzahl unterhalb des Cut-offs gewertet. Die Ergebnisse zeigen, dass die meisten Patienten mit Spermatozytenarrest sowohl im Stammzellpool als auch im Ablauf der Meiose einen Defekt aufwiesen, sodass sowohl die Anzahl der spermatogonialen Stammzellen als auch die Zellteilungsrate der Spermatozyten vermindert war. Die Patienten mit normaler Spermatogenese wiesen größtenteils keinen Defekt auf oder am zweithäufigsten im Stammzellpool. Dies lies die Interpretation zu, dass eine Verminderung der spermatogonialen Stammzellen durch eine normale oder gesteigerte Meioserate der Spermatozyten ausgeglichen werden kann (vgl. Borgers et al., 2014). Die Hypospermatogenese-Patienten zeigten eine gleichmäßige Verteilung zwischen keinem Defekt, Defekt im Stammzellpool oder Meiose-Defekt. Damit konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals die Verteilung der Defekte im Ablauf der Spermatogenese infertiler Patienten genauer kategorisiert und gezeigt werden, dass bereits die spermatogonialen Stammzellen vermindert waren und nicht ein alleiniger Defekt in der Meiose vorlag. The aim of the study was to characterize especially the late steps of the spermatogenesis of infertile men, so we used antibodies against UTF-1, AR (results of the doctoral thesis of Mr. M. Wolter) and H3Ser10-P, Smad3, CREM-1 and some antibodies against histones in rats and mice as well as in human testis. UTF-1 could be used as a marker for spermatogonial stem cells, AR for Sertoli cells, Smad3 for spermatocytes, H3Ser10-P for meiotic devisions and CREM-1 for round spermatids. The antibodies against histones were not suitable as markers for distinct germ cell stages but substantiated the thesis of the histone-code: methylation of histones was seen in phases of cell divisions (spermatogonia and spermatocytes) and acetylation was found in stages of high expression and DNA-replication. Thus, our results showed for the first time comparative localizations between rat, mouse and human testis. As a proof of principle, testis biopsy samples from 33 azoospermic patients with normal spermatogenesis, 33 patients with maturation arrest and 44 patients with hypospermatogenesis were studied and the antibodies were used as markers. To quantify the samples, we counted a minimum of ten tubular cross-sections. The correlations between the patient groups showed significant reductions of every intratubular cell type between NSP and MA and between HYP and MA. Between NSP and HYP only the numbers of spermatogonia and spermatocytes were significantly reduced. No correlation was found with age or obstruction. For a detailed analysis of the patients, a distinction was made between pool of founder cells -related deficiencies (reduced numbers of Sertoli cells, spermatogonia, and spermatogonial stem cells) and meiotic deficiencies (reduced numbers of spermatocytes, meiotic divisions, and spermatids). A deficiency was defined as a number below the cut-off. Interestingly, patients with maturation arrest showed meiotic deficiencies (36%), while the majority additionally demonstrated deficiencies in the founder pool (58%). In contrast, patients with normal spermatogenesis most often had no deficiencies at all (45%) or founder pool-related deficiencies (33%) but an apparently normal meiosis. Thus, it is possible that the reduction of spermatogonial stem cells is compensated by a normal or increased meiosis (Borgers et al., 2014). Patients with hypospermatogenesis showed a symmetric distribution between no defect, defect in the founder pool or meiotic defect. This is the first report showing that besides meiotic defects many infertile patients also face the problem of reduced numbers of Sertoli cells, spermatogonia, and spermatogonial stem cells.