Untersuchungen zur Funktion von Cullin-RING-Ligasen beim proteasomalen Abbau der durch Hypoxie induzierbaren Faktoren

Abstract

Neben den bekannten Funktionen im ER-assoziierten Proteinabbau (ERAD), wird der AAA-ATPase p97 zunehmend eine Rolle im UPS zugeschrieben. So wurde zum Beispiel erkannt, dass p97 und dessen Adapterprotein Ubxd7 im Turnover des CRL Substrats HIF-1alpha eine Rolle spielen, wobei Ubxd7 direkt über eine UIM-Domäne an das Nedd8 der neddylierten CRL bindet. CRLs sind mit ihrer Vielfalt an Substraten ein wichtiger Faktor für die Zellhomöostase und spielen eine große Rolle bei der Pathogenese maligner oder neurodegenerativer Erkrankungen. Während der Ubiquitylierungsprozess durch CRLs schon detailliert verstanden ist, ist der genaue Mechanismus ihrer Regulation noch zu großen Teilen unklar. Gerade der Interaktion mit Ubxd7 und p97 könnte ein neuer Mechanismus der CRL-Regulation oder Substrat-Prozessierung zu Grunde liegen. In dieser Studie konnte in Zellkultur-basierten Cycloheximid-Turnover-Assays unter Knockdown von Ubxd7 und p97 beobachtet werden, das Ubxd7 und p97 die Ubiquitiylierung von HIF-1alpha abhängig vom Neddylierungstatus der CRLs zu verändern scheinen. Turnover-Assays und in vitro-Ubiquitylierungsreaktionen mit einem HIF-1alpha-Peptid wiesen zudem auf eine CRL-inhibierende Rolle von Ubxd7 hin. Außerdem konnte erstmals gezeigt werden, dass HIF-1/2alpha als Cullin2VBC-Substrate völlig unabhängig von der Aktivität von Nedd8-E1 und somit unabhängig vom Neddylierungsstatus der CRLs abgebaut werden können. Die Frage, ob CRLs auch in vivo im deneddylierten Zustand HIFs ubiquitylieren und somit deren Abbau vermitteln können oder ob in diesem Fall verschiedene, alternative Abbauwege greifen, bleibt jedoch unbeantwortet.Weiterhin konnte mit Hilfe von Transfektions- und Pulldown-Experimenten das zytosolische und C-terminale HIF-1alpha-Abbauprodukt HDP-80 identifiziert werden, wobei ein möglicher Abbaumechanismus und die physiologische Rolle dieser Beobachtung Gegenstand weiterführender Experimente sein müssen. Zusammen genommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Ubxd7 möglicherweise die Funktion von CRLs inhibiert, und dass die Neddylierung für verschiedene Substrate von unterschiedlicher Bedeutung ist. Da die Neddylierung bereits Ziel pharmakologischer Therapien ist (MLN4924), wird es zukünftig von besonderem Interesse sein, wie und in welchem Maße CRL-Substrate davon abhängen. Currently, the protein p97, an AAA-ATPase involved in ER-associated protein degradation (ERAD), is becoming more and more linked to the ubiquitin proteasome system (UPS). Recently, it was described that p97, together with its adapter protein Ubxd7, is implicated in the turnover of the Cullin-RING ligase (CRL) substrate HIF-1alpha, whereby Ubxd7 through its UIM-domain directly interacts with the Nedd8-conjugated CRL. Regulating a plethora of substrates, CRLs play a pivotal role in cellular homeostasis as well as in the pathogenesis of malignancies and neurodegenerative diseases. While the process of ubiquitylation is well described, a detailed understanding of mechanisms regulating CRLs is still missing. Through their direct interaction with CRLs, p97 and Ubxd7 could potentially be involved in a new mechanism of CRL-regulation or substrate processing. Using tissue culture-based cycloheximide-turnover-assays and knockdowns of Ubxd7 and p97, it was observed that Ubxd7 and p97 seem to alter HIF-1alpha ubiquitylation dependent on the neddylation status of CRLs. Other results from turnover assays and in vitro ubiquitylation assays with a HIF-1alpha peptide also suggest an inhibitory role of Ubxd7 in CRL ubiquitylation reactions. Furthermore, it was shown for the first time that Cullin2VBC substrates HIF-1/2alpha can be degraded independently of Nedd8-E1 activity and CRL-neddylation. It remains unclear, whether either deneddylated CRLs are still able to ubiquitylate HIFs in vivo or if other alternative pathways mediate HIF-degradation while CRLs are deneddylated.Additionally, a cytosolic and C-terminal HIF-1alpha degradation product named HDP-80 was identified using transfection and pulldown experiments. A possible cleavage mechanism and a physiological role for HDP-80 need to be the focus of future investigations. Taken together, these results suggest that Ubxd7 possibly inhibits CRL function and that various CRL-substrates might depend to different degrees on CRL-neddylation. Since neddylation is already a target of pharmacological therapies (MLN4924), it will be of particular interest to determine why and how many CRL-substrates depend on neddylation.