Insulin modulates the recovery of endothelial barrier function via Rac1 activation

Abstract

The vascular endothelium forms a semi-permeable barrier between blood and interstitium controlling the exchange of water, small solutes, ions, macromolecules and blood cells across the vessel wall. Loss of EC barrier function results in leakage of blood components to interstitium and finally life threatening edema formation during pathophysiological conditions like inflammation and ischemia-reperfusion. Thus, restoration of EC barrier function is important to regain vascular barrier integrity and to prevent edema formation. However, little is known about the mediators and mechanisms involved in the recovery of compromised EC barrier function.The maintenance of EC barrier integrity is highly dependent on the VE-cadherin-based AJs and actomyosin-based EC contractile machinery. It is now well-established that the disruption of endothelial AJs and activation of EC contractile machinery are the key steps leading towards EC barrier failure under hyper-permeable conditions, a typical EC response to inflammatory mediators such as thrombin.Insulin is an essential hormone and a key regulator of metabolism. Additionally, it also confers protective effects on the cardiovascular system. Inflammatory mediators like thrombin disrupts EC barrier function, which is recovered slowly. Here, the hypothesis was addressed whether insulin can mediate a faster restoration of EC barrier function and the underlying signaling mechanism by which insulin recovers the EC barrier function was elucidated.Our data demonstrate that thrombin-induced hyperpermeability of HUVEC monolayers has accelerated recovery in the presence of insulin in a concentration-dependent manner with maximal effect at 1 IU/ml of insulin concentration. This barrier restoration effect of insulin in response to thrombin-induced hyperpermeability was blocked by a specific insulin receptor antagonist. Insulin also abolished reperfusion-induced vascular leakage in isolated-saline perfused rat hearts. Insulin-induced a rapid increase in Akt phosphorylation in HUVECs. Accordingly, inhibition of PI3K with wortmannin completely abolished the insulin-mediated EC barrier restoration, further supporting that the EC barrier recovery function of Insulin is via activation of PI3K/Akt pathway. However, MLCK and eNOS/NO signaling pathways are not involved ininsulin-mediated recovery of EC barrier function. Insulin attenuated thrombin-induced increase in MLC and MYPT1 phosphorylation and also fastens the re-establishment of VE-cadherin dependent endothelial AJs in response to thrombin challenge indicating a contractile inactivation and stabilization of cell-cell adhesion structures. Remarkably, inhibition of Rock has additive effect on insulin-mediated accelerated restoration of failed barrier. Insulin activated Rho GTPase Rac1 and pharmacological inhibition of Rac1 activity by using a specific inhibitor (NSC23766) abrogated the EC barrier recovery effect of insulin on cultured EC monolayers, as well as on reperfusion-induced vascular leakage in intact isolated-saline perfused rat heart, suggesting a Rac1-dependent phenomenon.In conclusion, insulin accelerates restoration of EC barrier function in response to thrombin-induced EC barrier disruption via enhancement of cell-cell adhesion structures and inactivation of the EC contractile machinery. Insulin also abolished reperfusion-induced vascular leakage in isolated saline perfused rat hearts. These EC barrier restoration effects of insulin are mediated via PI3K/Akt and Rho GTPase-Rac1 activation which plays a decisive role in insulin-mediated recovery of EC barrier function both in HUVEC monolayers and in isolated perfused rat hearts. Das vaskuläre Endothel stellt eine semipermeable Barriere zwischen Blut und Interstitium dar. Es kontrolliert den Austausch von Wasser, gelösten Substanzen, Ionen, Makromolekülen und Blutzellen durch die Gefäßwand. Unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen, beispielsweise bei Entzündung und Ischämie-Reperfusion, kann der Verlust dieser Schrankenfunktion zu einer Leckage der Blutkomponenten ins Interstitium und damit zu einem lebensbedrohlichen Ödem führen. Die Wiederherstellung der endothelialen Schrankenfunktion ist wichtig, um die vaskuläre Integrität zu erhalten und die Entwicklung von Ödemen zu verhindern. Allerdings ist bisher wenig über Mediatoren und Mechanismen bekannt, welche in die Erholung der Barrierenfunktion involviert sind. Der Erhalt der endothelialen Barrierenintegrität hängt einerseits von interzellulären Adhäsionsstrukturen (AJ) ab, die auf VE-Cadherin basieren, andererseits vom endothelialen kontraktilen Apparat, der auf Actin-Myosin basiert. Es ist bekannt, dass eine Zerstörung der endothelialen AJs und eine Aktivierung der endothelialen kontraktilen Elemente die Schlüsselschritte sind, die zum Verlust der Schrankenfunktion führen.Das essentielle Hormon Insulin ist ein wichtiger Stoffwechselregulator und hat zudem protektive Effekte im kardiovaskulären System. Entzündungsmediatoren wie Thrombin stören die endotheliale Schrankenfunktion, die sich dann nur langsam erholt. In dieser Studie wurde die Hypothese geprüft, ob Insulin eine beschleunigte Regeneration der endothelialen Barrierefunktion vermitteln kann und welche insulinvermittelten Signalwege hier zugrunde liegen.Unsere Ergebnisse zeigen, dass sich in Anwesenheit von Insulin die Thrombin-induzierte Hyperpermeabilität von HUVEC-Monolayern schneller regeneriert. Dieser Effekt ist konzentrationsabhängig. Die durch Insulin induzierte Erholung kann durch den spezifischen Insulinrezeptor-Inhibitor S961 blockiert werden. Des Weiteren kann durch Insulin die Reperfusions-induzierte vaskuläre Leckage in isolierten, salin perfundierten Rattenherzen aufgehoben werden. Insulin löst einen schnellen Anstieg der Akt-Phosphorylierung in HUVEC aus. Die Wiederherstellung der endothelialen Barrierefunktion ist hierbei abhängig vom PI3K/Akt-Signalweg. MLCK- und eNOS/NO-Signalwege sind nicht involviert. Insulin hemmt den Thrombin-induzierten Anstieg von MLC- und MYPT1-Phosporylierung und beschleunigt die Wiederherstellung der VE-Cadherin-abhängigen endothelialen AJs. Dies weist auf eine Inaktivierung des kontraktilen Apparates und auf eine Stabilisierung von Zell-Zell-Adhäsionsstrukturen hin. Eine ROCK-Hemmung hat einen additiven protektiven Effekt. Insulin aktiviert die Rho GTPase Rac1. Die pharmakologische Hemmung von Rac1 mithilfe spezifischer Inhibitoren (NSC23766) hebt bei Reperfusions-induzierter vaskulärer Leckage die Erholung der endothelialen Schrankenfunktion in isolierten EC Monoschichten von isolierten, salin perfundierten Rattenherzen durch Insulin auf. Dieser Effekt ist ein Hinweis für einen Rac-1 abhängigen Mechanismus.Schlussfolgernd ist zu konstatieren, dass Insulin die Erholung der EC Schrankenfunktion nach Thrombin-induziertem Schaden durch eine Verstärkung der Zell-Zell-Adhäsion und eine Inaktivierung des kontraktilen Apparates beschleunigt. Insulin hemmt zudem die vaskuläre Leckage von isolierten, salin perfundierten Rattenherzen. Diese protektiven Effekte werden über einen PI3K/Akt- und Rho GTPase-Rac1 Signalweg vermittelt und spielen eine entscheidende Rolle bei der insulinvermittelten Erholung der endothelialen Schrankenfunktion sowohl in HUVEC als auch in isolierten, salin perfundierten Rattenherzen.