Die Expression von Cyclin D2 in männlichen Keimzellen normaler und pathologischer Differenzierung

Abstract

Es ist bekannt, dass Cycline vom D-Typ als Regulatoren des Zellzyklus den Übergang von der frühen G1-Phase in die S-Phase steuern und so die mitotische Zellteilung einleiten. Eine Amplifikation des Cyclin D2-Gens und eine Überexpression des Cyclin D2-Proteins konnte aufgrund früherer Studien nicht nur in invasiven Keimzelltumoren (Seminomen und embryonalen Karzinomen) sondern auch in präinvasiven CIS-Läsionen nachgewiesen werden. Frühere Befunde an Cyclin D2-defizienten männlichen Mäusen und wenige immunhistochemische Daten vom adulten humanen Hoden lassen vermuten, dass Cyclin D2 nicht nur eine wichtige Rolle in der Pathogenese testikulärer Keimzelltumoren spielt, sondern auch für die normale Hodenentwicklung und Spermatogenese im adulten Hoden essentiell sein kann.Ziel der vorliegenden Studie war der Vergleich der Cyclin D2-Expression im normalen adulten Hoden, in CIS-Läsionen und Seminomen. Dazu wurde das Vorkommen von Cyclin D2-mRNA und -Protein im adulten humanen Hoden mit normaler Spermatogenese und in verschiedenen Formen testikulärer Tumore mittels Immunhistochemie, Western Blot und in situ Hybridisierung am Gewebehomogenat untersucht. Zudem kam als äußerst sensitive Methode die Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) an einzelnen Keimzellpopulationen zur Anwendung, die mittels Laser Cell Mikrodissektion (LCMD) isoliert wurden. Eine Überexpression von Cyclin D2 in präinvasiven CIS-Läsionen und Seminomen zeigte sich auf Proteinebene immunhistochemisch und mithilfe des Western Blots sowie auf RNAEbene mittels in-situ Hybridisierung. Der Western Blot belegte das Cyclin D2-Vorkommen auch im adulten Hoden. Darüber hinaus war durch Isolierung testikulärer Zellprofile mittels LCMD kombiniert mit hochsensitiver RT-PCR der Nachweis von Cyclin D2 in sämtlichen Keimzellstadien des Humanhodens von Spermatogonien über Spermatozyten und runden Spermatiden bis hin zu elongierten Spermatiden möglich. Während Myofibrozyten und Sertoli-Zellen keine Signale ergaben, war Cyclin D2-mRNA in interstitiellen Leydigzellen nachweisbar. Die Detektion einer Überexpression von Cyclin D2 in präinvasiven CISLäsionen und Seminomen bestätigt frühere Resultate. Die vorliegenden Nachweise einer Cyclin D2-Expression in sämtlichen Keimzellstadien des normalen Hodens deuten auf neue von der Proliferation unabhängige Funktionen des Cyclin D2 in der Spermatogenese des adulten humanen Hodens hin. It is well established that D-type cyclins as regulators of the cell cycle govern the passage from early G1-phase to S-phase and in this way initiate cell division. Earlier studies have indicated gene amplification and overexpression of cyclin D2 not only in invasive germ cell tumours but also in preinvasive CIS lesions. Previous findings on cyclin D2-deficient male mice and immunohistochemical data of adult human testis suggest that cyclin D2 not only plays an important role in developing testicular germ cell tumours but also is essential for development and spermatogenesis of normal adult testis.The aim of this study was to compare the expression of cyclin D2 in normal adult testis, CISlesions and testicular tumours. To this end, the possible occurrence of cyclin D2-mRNA and -protein in adult human testis with normal spermatogenesis and in different types of testicular tumours was investigated using immunohistochemistry, Western blot analysis and in situ hybridization from tissue homogenate. Moreover, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used on different germ cell populations, which were isolated by Laser Cell Microdissection (LCMD).Overexpression of cyclin D2 appeared on the protein level by means of immunohistochemistry and Western blot as well as on the RNA level by means of in situ hybridization in preinvasive CIS and seminomas. Western blot analysis demonstrated the presence of cyclin D2 also in normal adult testis. Further, due to isolating testicular cell profiles by LCMD in combination with highly sensitive RT-PCR it was possible to detect cyclin D2-mRNA in all stages of male germ cells in adult human testis from spermatogonia over spermatocytes and round spermatids to elongated spermatids. While no cyclin D2-mRNA was found in myofibrocytes and Sertoli cells, cyclin D2-mRNA was detectable in interstitial Leydig cells. Detection of cyclin D2-overexpression in preinvasive CIS lesions and invasive seminomas confirm earlier results. The present evidences of cyclin D2-expression in all stages of male germ cells in adult human testis imply novel proliferation-independent functions of cyclin D2 during spermatogenesis of the adult human testis.