Die Flotillin-Proteinfamilie: Rolle bei der cholinergen EGFR-Transaktivierung und beim Arf-vermittelten Membrantransport

Abstract

Als bedeutender autokriner/parakriner Signalüberträger konnte Acetylcholin (ACh) in einer Vielzahl nicht-neuronaler Zellen nachgewiesen werden. Insbesondere Keratinozyten dienen als ein gut untersuchtes Modell des non-neuronalen cholinergen Systems (NNCS), welches an der Regulation vieler wichtiger Zellfunktionen, wie der Proliferation, Differenzierung, Migration und der Wundheilung in diesen Zellen beteiligt ist. ACh wirkt grundsätzlich auf zwei unterschiedliche Rezeptortypen, die nikotinischen und muskarinischen Acetylcholin-Rezeptoren. Muskarinische Acetylcholin-Rezeptoren (mAChRs) gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), wobei durch ihre Kopplung an bestimmte heterotrimere Guanin-Nukleotid-bindende Proteine (sog. G-Proteine) die Initiierung der mAChR-vermittelten Signaltransduktion erfolgt. Dabei koppeln die exzitatorischen M1, M3 und M5 mAChR-Subtypen bevorzugt an die Pertussis-Toxin-insensitiven Galphaq und Galpha11-Untereinheiten der trimeren G-Proteine, wobei die M2 und M4-Subtypen vorzugsweise an die inhibierenden Galphai/0-Proteinuntereinheiten gekoppelt sind. Diese Kopplung an bestimmte G-Proteinuntereinheiten ist grundlegend für die Signaltransduktion nach der Aktivierung von mAChRs. Die Interaktion von GPCRs mit der trimeren G-Proteinuntereinheit bewirkt die Aktivierung (GTP-Bindung) der alpha-Untereinheit und deren Dissoziation von der betagamma-Untereinheit des trimeren G-Proteins. Die alpha-Untereinheit und das betagamma-Heterodimer interagieren im Folgenden mit nachgeschalteten Effektoren verschiedenster Signaltransduktionswege, wobei sowohl die alpha- als auch die betagamma-Untereinheit u.a. die Aktivierung der MAPK (mitogen-activated protein kinase)-Signalkaskade vermitteln können. Die Aktivierung der M1, M3 und M5 mAChRs führt zur Aktivierung von Membran-assoziierten Enzymen, wie der Phospholipase C und Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphat-Kinase, infolgedessen Diacylglycerol und der sekundäre Botenstoff Inositol-trisphosphat gebildet und intrazelluläres Calcium mobilisiert wird. Die dadurch bewirkte Aktivierung der Proteinkinase C führt zur Ras/Raf-vermittelten Aktivierung von ERK1/2 und nachgeschalteter MAPK-Signalwege. Die Aktivierung von M2 und M4 mAChRs bewirkt wiederum die Inhibierung der Adenylatzyklase und somit die Reduktion des intrazellulären cAMP-Levels. Ebenso sind mAChRs durch einen cholinergen Transaktivierungsmechanismus von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen an der Aktivierung der MAPK-Signaltransduktion beteiligt. Dabei führt der Mechanismus des Triple-Membrane-Passing-Signalwegs (TMPS) zur mAChR-induzierten Aktivierung von Metalloproteinasen der MMP/ADAM-Familie, die zur Prozessierung von Membran-ständigen EGF-ähnlichen Liganden und letztendlich zur autokrinen und/oder parakrinen Aktivierung von epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFRs), sowie zu dessen nachgeschalter MAPK-Aktivierung führt. Die aktivierte MAP-Kinase ERK1/2 aktiviert zytoplasmatische Substrate oder nach Translokation in den Nukleus verschiedene Transkriptionsfaktoren, wie cFos und Egr1.In dieser Arbeit sollten die durch die cholinerge EGFR-Transaktivierung und Aktivierung der MAPK-Signalkaskade vermittelten transkriptionellen Effekte, welche die Expression von MAPK-Zielgenen, sowie Genen für EGF-ähnliche Liganden und Metalloproteasen der MMP- und ADAM-Familie regulieren, untersucht werden. Zusätzlich sollte eine mögliche transkriptionelle Regulation von Flotillin-Genen durch die cholinerge EGFR/MAPK-Aktivierung und der Einfluss von Flotillinen auf die transkriptionelle Regulation der untersuchten Gene näher betrachtet werden. In HaCaT-Keratinozyten führt die mAChR-vermittelte EGFR-Transaktivierung nach cholinerger Stimulation zu einer MMP/ADAM-abhängigen Aktivierung der MAPK-Signalkaskade. Anhand der quantitativen RT-PCR-Analyse wurde in diesem Kontext die CCh-vermittelte Induktion der MAPK-Zielgene Egr1, cFos und Dusp1 in HaCaT-Keratinozyten untersucht. Dabei konnte die cholinerge Induktion dieser MAPK-Zielgene gezeigt werden. Insbesondere für CCh-induzierte Egr1-Genexpression konnte eine vollständige Abhängigkeit von der mAChR-vermittelten EGFR-Transaktivierung und MAPK-Aktivierung nachgewiesen werden. Die cholinerg-induzierte Genexpression von cFos und Dusp1 wiederum wird nicht komplett durch die cholinerge EGFR-Transaktivierung vermittelt, sondern zusätzlich durch weitere cholinerg-aktivierte Signalwege unabhängig der EGFR/MAPK-Aktivierung reguliert. Die Analyse der cholinergen Induktion von Genen der EGF-ähnlichen Liganden ergab einen Anstieg der Gentranskription von TGFalpha, HB-EGF, AREG und EREG nach CCh-Stimulation von HaCaT-Keratinozyten. Für die CCh-induzierte Induktion von EREG konnte eine Abhängigkeit von der mAChR-vermittelten EGFR-Aktivierung, nicht aber von der MAPK-Aktivierung gezeigt werden, was auf eine Genregulation von EREG durch weitere cholinerg aktivierte Signalwege hinweist. Zudem wurde die cholinerge Induktion von MMPs/ADAMs untersucht, wobei die Expression von MMP-1, MMP-2, MMP-3, sowie ADAM8 und ADAM17 in HaCaT-Zellen nachgewiesen werden konnte. Die CCh-induzierte Expressionsregulation von MMP-3 zeigte zusätzlich eine deutliche Abhängigkeit von der mAChR-vermittelten Transaktivierung und des nachgeschalteten MAPK-Signalweg. Die cholinerge Induktion spezifischer EGFR-Liganden und MMPs/ADAMs weist zusätzlich auf einen feed-forward Mechanismus hin, der durch die cholinerge EGFR-Transaktivierung vermittelt wird. Dieser Mechanismus führt zu einer erhöhten Transkription von Genen, deren Genprodukte an der EGFR-Transaktivierung beteiligt sind, das wiederum durch eine vermehrte Produktion bestimmter MMPs/ADAMs und EGF-ähnlicher Liganden die Aufrechterhaltung des Transaktivierungsmechanismus fördert. Zusätzlich konnte eine cholinerge Induktion von Flotillinen auf mRNA- und Proteinebene beobachtet werden. Übereinstimmend damit konnten in vorherigen Studien Bindungsstellen für Egr1 und den Serum response Faktor (SRF) in der Promotorregion von Flotillinen identifiziert werden, wodurch die Genexpression von Flotillinen mit ERK1/2 bzw. Egr1 als bedeutende positive Transkriptionsregulatoren reguliert wird. Die Rolle von Flotillinen, insbesondere Flotillin-1, in der EGFR/MAPK-Aktivierung konnte bereits beschrieben werden, wobei in dieser Studie korrelierend damit eine deutliche Reduktion der MAPK-Zielgene Egr1 und Dusp1 durch eine Depletion von Flotillin-1 gezeigt werden konnte. Zusätzlich wurde eine Reduktion der cholinergen Induktion von HB-EGF, TGF-alpha, AREG, EREG und MMP-3 durch die Depletion von Flotillin-1 bewirkt. Eine Depletion von Flotillin-2 zeigte wiederum keinen Effekt auf die cholinerge Induktion der untersuchten Gene, was auf einen Kompensationsmechanismus des verbleibenden Flotillin-1 hinweist. Acetylcholine (ACh) is an important auto-/paracrine mediator in the regulation of a variety of cellular functions, like the cell communication and signal transduction of neuronal but also non-neuronal cells. Generally, ACh acts on both muscarinic and nicotinic subtypes of ACh receptors. Muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) belong to the family of G-Protein coupled receptors (GPCRs), which contain a conserved structural motif of seven alpha-helical transmembrane domains. The five mAChR-subtypes (referred as M1 to M5) are able to initiate a number of intracellular signal transduction pathways dependent on their bound GTP-binding protein (G protein). The excitatory M1, M3 and M5 mAChRs are preferentially coupled to Galphaq and Galpha11-subunits of G-proteins, whose activation results in an increased level of diacylglycerol and inositol-trisphosphate. The inhibitory M2 und M4 subtypes mainly interact with Galphai/0-subunits of heterotrimeric G-proteins, which leads to inhibition of the adenylyl cyclase and subsequently to a reduced level of cAMP. Beside the canonical pathway, mAChRs are able to indirectly activate the MAPK-signal transduction via the EGFR signal transactivation pathway. The mAChR-mediated EGFR-transactivation takes place through a so called triple-membrane-passing-signal (TMPS) pathway, which involves the activation of matrix metalloproteinases (MMPs/ADAMs) and subsequently the proteolytic cleavage of membrane-bound EGF-like ligand-precursors. The release of active EGF-like ligands leads to an autocrine and/or paracrine activation of the EGFR and downstream MAPK signal pathway, as well as to ERK-mediated transcriptional response. The highly conserved and ubiquitously expressed flotillins are constitutively associated with cholesterol- and sphingolipid-enriched membrane microdomains (membrane rafts) by acylations. The ability of flotillin to oligomerize induces the formation of flotillin microdomains that serve as signaling platforms involved in the regulation of several cellular processes, including membrane trafficking and signal transduction. Thus, flotillins play an important role in the EGFR activation and downstream MAPK-signaling. Upon stimulation with the epidermal growth factor (EGF), flotillins are tyrosine-phoshorylated by Src-kinase that initiates the translocation of flotillins from the plasma membrane to endosomal compartments via an endocytotic pathway that is postulated to be clathrin-independent. ADP-ribosylation factors (Arfs) are small GTPases of the Ras-superfamily that cycle between an inactive, cytoplasmic GDP-bound and a membrane-associated, active, GTP-bound state. Arf6 is involved in the regulation of the phospholipid-metabolism, rearrangement of the cortical actin cytoskeleton and in membrane transport processes, such as recycling and the clathrin-dependent and independent endocytosis. Independently of the endocytotic pathway, Arf6 participates in the internalization of many GPCRs, such as M2 mAChRs.The major aim of this study was to address the transcriptional effects that are mediated through the cholinergic transactivation of the EGFR by mAChRs and the role of flotillins in the cholinergic EGFR/MAPK-activation. The present study shows the cholinergic induction of the MAPK target gene Egr1 which is also a positive transcriptional regulator of the flotillin-gene expression. Consistent with the induced Egr1-expression, cholinergic stimulation of HaCaT cells results in increased flotillin expression. In order to test the cholinergic effect on the expression of selected EGF-like ligands and MMPs/ADAMs that are mediated by the MAPK pathway, the present study reveals a cholinergic induction of TGFalpha, HB-EGF, AREG and EREG. Interestingly, upregulation of EREG upon cholinergic stimulation is induced dependently of the mAChR-mediated EGFR-transactivation, but independs on MAPK-activation, suggesting a regulation of EREG-gene expression via an additional cholinergic signal pathway. In addition, the expression of MMP-1, MMP-2, MMP-3 as well as ADAM8 and ADAM17 could be detected in HaCaT keratinocytes, whereas the cholinergic induction of MMP-3 is strongly dependent of the mAChR-mediated EGFR-transactivation mechanism and the downstream MAPK activation. Thus, the cholinergic induction of specific EGF-like ligands and MMPs/ADAMs implicates the existence of a feed-forward mechanism, which leads to an increased level of activating EGFR ligands and sheddases to facilitate the EGFR transactivation mechanism. Consistent with the role of flotillins, especially flotillin-1, in the EGFR-MAPK activation, depletion of flotillin-1 results in an impaired transcriptional induction of the MAPK target genes Egr1 and Dusp1 and the EGF-like ligands HB-EGF, TGF-alpha, AREG, EREG, as well as MMP-3 upon cholinergic stimulation. The cholinergic induction of these genes is not affected by knockdown of flotillin-2. Therefore, this study shows the requirement of flotillin-1 for the cholinergic induced transcriptional regulation of these genes mediated via mAChR downstream signaling processes. In order to study a functional connection between flotillins and Arf6, this study shows an interaction between flotillins and Arf6. Furthermore, depletion of flotillins results in a reduced activity of Arf6-WT, implicating an Arf6-effector function of flotillins. Overexpression of Arf6-WT prevented flotillin-2 from localizing to the plasma membrane in cells grown without serum, whereas a clear effect on the EGF-induced endocytosis of flotillin-2 was not observed. However, a dominant-negative Arf6 may exhibit an inhibitory effect on flotillin-2 endocytosis. The cooperation between flotillins and Arf6 in endosomal transport processes was investigated by overexpression of Arf6-WT and the Arf6-cargo BACE-1. In the presence of flotillins, overexpression of Arf6-WT leads to the formation of grape-like clusters of Arf6-positive vacuoles but does not grossly affect BACE-1 localization. However, knockdown of flotillins results in an accumulation of BACE-1 in perinuclear regions but this is most likely not dependent on Arf6. A direct binding of flotillins to the dileucine motif on the C-terminal tail of BACE-1 has been shown, suggesting a role of flotillins in endosomal sorting of BACE-1. Furthermore, previous studies implicate an additional role of Arf6 in the BACE-1 sorting. Altogether, the results of this study unveil a novel functional connection between flotillins and Arf6 in the context of membrane transport processes.