Macrophage migration inhibitory factor (MIF) but not its homologue D-dopachrome tautomerase (D-DT) promotes fibroblast motility in a CD44/CD74-independent manner

Abstract

Macrophage migration inhibitory factor (MIF) and D-dopachrome tautomerase (D-DT) are paralogous pro-inflammatory cytokines. Whereas cytosolic MIF plays a role in cell cycle progression, secreted MIF and D-DT activate second messenger signalling through a CD44/CD74 receptor complex. Using an interactome screen, cytosolic MIF/D-DT were found to interact with many actin cytoskeleton-associated proteins in NIH3T3 fibroblasts suggesting a direct involvement of MIF/D-DT in modulating cell motility, but whether the receptors are indispensable for mediating motility remains elusive. To differentiate between receptor- and non-receptor-mediated events, COS-7/M6 fibroblasts deficient in CD44/CD74 (WT) and stable cell lines expressing CD44 and CD74 were generated. Chemokinesis (random single-cell motility) was assessed in cells stimulated with recombinant MIF/D-DT, mutated forms of MIF, inhibitors of MIF s tautomerase activity, and inhibitors of clathrin- and non-clathrin-dependent endocytosis. Due to low D-DT s tautomerase activity, ISO-1/4-IPP were not tested with D-DT. In the presence of CD44/CD74, both MIF and D-DT stimulated chemokinesis but only MIF enhanced chemokinesis in the absence of receptors. The stimulatory effect of MIF on migration depended on its tautomerase activity and lipid raft/caveolae-mediated but not clathrin-mediated endocytosis. To observe a direct effect of MIF and D-DT on actin dynamics, actin polymerization was measured in an in vitro actin assembly assay. MIF but not D-DT decreased the rate of F-actin assembly. By decreasing the rate of cell extract-driven actin assembly, MIF phenocopies the function of F-actin capping proteins. Moreover, stimulation with MIF increased the number of prominent F-actin stress fibres in COS-7/M6 WT. Taken together, MIF stimulates fibroblast chemokinesis independent of the status of its cell-surface receptors, likely by directly modulating the actin cytoskeleton. MIF-mediated chemokinesis appears to depend on lipid raft/caveolae-mediated endocytosis. D-DT triggers chemokinesis only in the presence of MIF/D-DT receptors CD44/CD74 implying D-DT requires the classical receptor-driven second-messenger transduction pathway. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) und D-dopachrome tautomerase (D-DT) sind paraloge pro-inflammatorische Zytokine. Zytosolisches MIF spielt bei der Progression des Zellzyklus eine Rolle, während sekretiertes MIF und D-DT intrazelluläre Signalkaskaden über eine Aktivierung eines CD44/CD74 Rezeptorkomplexes modulieren können. Mittels Interaktom-Screening in NIH3T3 Fibroblasten wurde gefunden, dass zytosolisches MIF/D-TT mit Zytoskelett-assoziierten Proteinen interagiert. Darauf basierend wurde postuliert, dass MIF/D-DT die Motilität von Zellen moduliert. Ob hier eine Aktivierung der Membranrezeptoren eine Rolle spielt, ist bislang unbekannt. Um zwischen Rezeptor-vermittelten und Rezeptor-unabhängigen Mechanismen zu unterscheiden, wurden CD44/CD74-defiziente COS-7/M6 Fibroblasten (WT) verwendet, sowie Zelllinien erzeugt, welche stabil CD44 und CD74 exprimieren. Chemokinese (random single-cell motility) wurde an Zellen untersucht, die mit rekombinantem MIF/D-DT, mutierten Formen von MIF, Inhibitoren der Tautomerase-Aktivität von MIF, sowie Inhibitoren von Clathrin-abhängiger und Clathrin-unabhängiger Endozytose, stimuliert wurden. Aufgrund der geringen D-DT Tautomeraseaktivität, ISO-1/4-IPP wurden nicht mit D-DT getestet. In der Anwesenheit von CD44/CD74 stimulierten sowohl MIF als auch D-DT die Chemokinese, allerdings war nur MIF hierbei in der Lage, in Abwesenheit der Rezeptoren zu stimulieren einen stimulierenden Einfluss auf die Chemokinese auszuüben. Der stimulierende Effekt von MIF basierte auf dessen Tautomerase-Aktivität und wurde durch Lipid raft/Caveolae-abhängige nicht jedoch Clathrin-abhängige Endozytose vermittelt. Um einen möglichen direkten Effekt von MIF und D-DT auf die Aktin-Dynamik zu untersuchen, wurde mittels eines Aktin-Assemblierungs-Assays die Aktin-Polymerisation in vitro gemessen. MIF, nicht aber D-DT, verminderten die Assemblierungsrate von F-Aktin. Wahrscheinlich beruht dies auf einer F-Actin Capping Protein-analogen Funktion von MIF. Darüber hinaus führte die Stimulation mit MIF zu einer erhöhten Anzahl an prominenten F-Aktin Stressfasern in COS-7/M6 (WT) Zellen. Zusammengefasst stimulierte MIF die Chemokinese von Fibroblasten, unabhängig von Membranrezeptoren, über direkte Modulation des Aktin-Zytoskeletts. Die MIF-stimulierte Chemokinese basierte auf Lipid raft/Caveolae-abhängiger Endozytose. Dagegen stimulierte D-DT die Chemokinese nur in Anwesenheit der Membranrezeptoren CD44/CD74, was vermutlich auf einer klassischen Rezeptor- und second messenger-vermittelten Signalkaskade beruht.