Die Rolle von kleinen nichtkodierenden RNAs bei der Kälteschockantwort und Kälteadaptation von Listeria monocytogenes

Abstract

Listeria monocytogenes kann durch den Verzehr kontaminierter Lebensmittel bei Schwangeren, Neugeborenen, alten und immunsupprimierten Patienten eine potentiell tödlich verlaufende Listeriose hervorrufen. Von großer Bedeutung ist dabei die Fähigkeit der Bakterien, sich auch bei Kühlschranktemperaturen vermehren zu können. Um Kontaminationen und Krankheitsfälle einzudämmen ist es notwendig, die molekularen Mechanismen, die Wachstum und Virulenz bei niedrigen Temperaturen ermöglichen, zu verstehen. Welche Rolle kleine nichtkodierende RNAs dabei spielen, ist Gegenstand der vorliegenden Dissertation.Eine dieser Arbeit vorangegangene RNA-Sequenzierung hatte ergeben, dass sRNAs bei 37 °C und 1 h, 2 h und 24 h nach einem Kälteschock von 37 auf 15 °C differentiell exprimiert werden. Auf dieser Grundlage wurden besonders stark regulierte sRNAs ausgewählt und näher charakterisiert. Die Deletion einzelner sRNAs zeigte bis auf wenige Ausnahmen keine signifikanten Auswirkungen auf das Wachstum nach Kälteschock und bei permanentem Kältewachstum bei 4 und 15 °C. Mit RT-PCR und qRT-PCR konnten die Transkriptionsprofile der RNA-Sequenzierung für rli44, rli47, rli78, FMN, ssrA, ssrS und rnpB nur teilweise bestätigt werden. Eine Proteinanalyse der sRNA-Deletionsmutanten deltarli78, deltarli50*, deltarli78deltarli50* und deltarli47 ergab nach Kälteschock keine Unterschiede zum Wildtyp und zu 37 °C. Die sRNA rli47 ist nach 24-stündigem Wachstum bei 15 °C besonders stark hochreguliert und wurde deshalb in Infektionsversuchen untersucht. Die Invasionsfähigkeit der Mutante in Caco-2-Zellen war 24 h nach Kälteschock signifikant schlechter als die des Wildtyps EGD-e, ebenso unter Standardbedingungen bei 37 °C. Bei der Infektion der Wachsmotte Galleria mellonella zeigten sich keine Unterschiede in der Virulenz zwischen Mutante und Wildtyp. Auffällig war jedoch eine niedrigere Überlebensrate der Larven nach Infektion sowohl mit Wildtyp als auch Mutante nach dem Kälteschock als unter Standardbedingungen bei 37 °C. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass einzelne sRNAs an Wachstum und Virulenz von L. monocytogenes unter bestimmten Kältebedingungen beteiligt sind. Eine Deletion des Großteils der untersuchten sRNAs führte jedoch unter den getesteten Konditionen zu keinen phänotypischen Auswirkungen. Listeria monocytogenes is able to cause the potentially deadly illness listeriosis in pregnant women, newborns, the elderly and immunocomprised patients due to the consumption of contaminated food. Therefore, the ability of the bacteria to grow at refrigeration temperatures has significant implications. To reduce contamination and disease outbreaks, it is necessary to understand the molecular mechanisms that enable growth and virulence at low temperatures. Topic of this dissertation is to understand the role of small noncoding RNAs in this connection.A preceding RNA-sequencing has shown that sRNAs are expressed differentially at a temperature of 37 °C and furthermore 1 h, 2 h, and 24 h after cold shock from 37 to 15 °C. Based on this observation highly regulated sRNAs were selected and characterized in detail. The deletion of individual sRNAs has shown with few exceptions - no significant implications on their growth after cold shock and at permanent cold growth at temperatures of 4 and 15 °C. The transcription profiles of the RNA-sequencing for rli44, rli47, rli78, FMN, ssrA, and rnpB could only be partially confirmed with the help of RT-PCR and qRT-PCR. A protein analysis of the sRNA deletion mutants deltarli78, deltarli50*, deltarli78deltarli50* and deltarli47 has shown no differences to the wildtype after cold shock exposure as well as at a temperature exposure of 37 °C. After growing for 24 h at a temperature of 15 °C the sRNA rli47 has significantly increased and was therefore selected for infection assays. The mutant s ability to invade Caco-2-cells deteriorated significantly 24 h after cold shock exposure as well as at a temperature of 37 °C compared to that of the wild-type EGD-e. The infection of the greater wax moth Galleria mellonella showed no differences in virulence between the mutant and wild-type. However, one point was striking: there was a lower survival rate of the larvae after infection with both wild-type and mutant after the cold shock and under standard conditions of a temperature of 37 °C.The present study has shown that individual sRNAs are involved in the growth and virulence of L. monocytogenes under certain cold temperature conditions. The deletion of the majority of the sRNAs examined here did not result in having any phenotypic implications under the experimental conditions.