Caveolin-3: structural and functional insights into its role in murine airway smooth muscle constriction

Abstract

Acetylcholine (ACh) and serotonin are bronchoconstrictors clinically relevant in airway diseases associated with airway hyperreactivity. Their receptors are incorporated in membrane signaling platforms termed caveolae. These are omega-shaped invaginations of the plasma membrane with a caveolar coat protein complex consisting of caveolins (Cav-1, -2 and -3) and cytoplasmic adapter proteins (cavin-1 to -4). There is evidence that Cav-3 might organize this caveolar coat complex in airway smooth muscle (ASM). To address this issue, we generated Cav-3-deficient mice to address the functional role of Cav-3 in ASM constriction using organ bath recording from extrapulmonary and videomicroscopy of precision cut-lung slices from intrapulmonary airways. Immunofluorescence, RT-PCR, real-time PCR, Western blotting and co-immunoprecipitation served to address the distribution and molecular composition of the caveolar coat complex in murine and human airways. Cav-3 was found in tracheal epithelium and ASM and was associated with Cav-1, cavin-1 and cavin-4. Cav-3 deficiency neither had impact on protein expression of caveolar coat complex members nor on EHD-2 expression, a caveolae abundancy marker. Thus, specific aspects of caveolar function rather than caveolar abundancy are dependent on the expression of Cav-3. The response of extrapulmonary airway to muscarine was not altered in Cav-3-/- mice, whereas a considerable increase in muscarinic bronchoconstriction was observed in Cav-3-/- intrapulmonary bronchi. This demonstrates an inhibitory regulatory role of Cav-3 in cholinergic bronchoconstriction. Cav-3 was previously found to interact with the muscarinic receptor subtype 2 (M2R) in bronchial SM, and in cardiac myocytes it couples M2R stimulation with endothelial NO synthase (eNOS) activation. Thus, the depletion of Cav-3 might cause an increased muscarine-induced bronchoconstriction through disruption of M2R-Cav-3-eNOS. Cav-3 deficiency fully abrogated serotonin-induced constriction of extrapulmonary airways while leaving intrapulmonary airways unaffected. Serotonergic airway constriction in murine extrapulmonary is considered to be indirectly mediated through ACh release from epithelial cells or nerve fibers. Since muscarinic constriction of extrapulmonary airways was unaffected in Cav-3-/- mice, the cholinergic component of this indirect effect shall not be responsible for the abrogated serotonergic effect. The selective expression of Cav-3 in epithelial cells present in tracheal but not in intrapulmonary bronchial epithelial cells might explain the differential effects of Cav-3 deficiency on serotonergic ASM constriction. Potentially, these data warrant consideration during pharmacological modulation of the cholinergic and serotonergic responses and provide an opportunity to modulate airway hyperreactivity. Acetylcholin (ACh) und Serotonin sind Bronchokonstriktoren von hoher klinischer Relevanz bei Erkrankungen, die mit bronchialer Hyperreagibilität einhergehen. Ihre Rezeptoren sind in spezialisierten Membrandomänen, Caveolae, organisiert. Dies sind omega-förmige Membraneinstülpungen mit einem Proteingerüst aus Caveolinen (Cav-1, -2 und -3) und zytoplasmatischen Adapterproteinen (cavin-1 bis -4). Es gibt Hinweise, dass Cav-3 diesen Proteinkomplex in der glatten Atemwegsmuskulatur (ASM) organisiert. In dieser Arbeit wurde ein Cav-3-defizienter Mausstamm generiert und die funktionelle Rolle von Cav-3 in der ASM Konstriktion in Organbaduntersuchungen extrapulmonaler und videomikroskopischen Untersuchungen intrapulmonaler Bronchi in lebenden Lungenschnitten ermittelt. Die Verteilung und molekulare Zusammensetzung des caveolären Proteinkomplexes wurde mittels Immunfluoreszenz, RT-PCR, real-time PCR, Western blotting und Ko-Immunpräzipitation in Atemwegen der Maus und des Menschen untersucht. Cav-3 fand sich im Trachealepithel sowie ASM und war mit Cav-1, cavin-1 und cavin-4 assoziiert. Cav-3- Defizienz hatte weder auf die Expression anderer Proteinkomplexmitglieder, noch auf die von EHD-2, ein Strukturmarker von Caveolae, Einfluss. Cav-3 determiniert daher zwar spezifische Aspekte der Caveolenfunktion, nicht aber die strukturelle Ausbildung von Caveolae. Die Reaktion extrapulmonaler Atemwege auf Muskarin war unverändert in Cav-3-/- Mäusen, während die muskarinergen Konstriktion intrapulmonaler Bronchi zunahm. Dies zeigt eine inhibitorische Regulation der cholinergen Bronchokonstriktion durch Cav-3. Für Cav-3 wurde bereits eine Interaktion mit dem muskarinischen Rezeptorsubtyp 2 (M2R) in bronchialen Glattmuskelzellen gezeigt, und es koppelt den M2R mit Aktivierung der endothelialen NO-Synthase (eNOS) in Kardiomyozyten. Der Verlust von Cav-3 könnte daher die muskarinerge Bronchokonstriktion durch Aufhebung der M2R-Cav-3-eNOS-Koppelung verstärken. Die serotonininduzierte Konstriktion extrapulmonaler Atemwege war bei Cav-3-Defizienz völlig aufgehoben, während die der intrapulmonalen Bronchi unverändert blieb. Bei der serotonergen Kontraktion der extrapulmonalen Atemwege der Maus wird von einer indirekten Wirkung auf das Epithel oder Nervenfasern mit folgender ACh-Freisetzung ausgegangen. Da die cholinerge Konstriktion der extrapulmonalen Atemwege in Cav-3-/-- Mäusen unverändert war, ist diese Komponente der indirekten Wirkung nicht für den Verlust der serotonergen Kontraktion verantwortlich. Die selektive Expression von Cav-3 in trachealen, aber nicht bronchialen Epithelzellen, könnte den differenziellen Effekt der Cav-3-Defizienz auf die serotonerge ASM Konstriktion der verschiedenen Abschnitte erklären. Diese Daten sind bei der pharmakologischen Modulation der cholinergen und serotonergen Effekte zu berücksichtigen und könnten eine zusätzliche Möglichkeit zur Beeinflussung der Atemwegshyperreagibilität bieten.