Charakterisierung einer neuen Aspartylglukosaminurie-Mutation

Abstract

Aspartylglukosaminidase (kurz: AGA) ist eine lysosomale Hydrolase, welche am Abbau von Glykoproteinen beteiligt ist. Dieses Enzym katalysiert die Spaltung der N-glykosidischen Bindung zwischen Asparagin und N-Acetylglukosamin. AGA wird als inaktive 346 Aminosäuren große Vorstufe synthetisiert. Es wird zügig in Alpha- und Beta-Untereinheiten gespalten. AGA wird autoproteolytisch durch Dimerisierung von zwei inaktiven Molekülen aktiviert. Das aktive AGA ist ein tetrameres Molekül, welches über den Mannose-6-Phosphat-Transportweg zu den Lysosomen gelangt (Tikkanen et al. 1995, 1997). Wildtyp AGA ist sehr hitzestabil und resistent gegen Denaturierung durch SDS (Tollersrud und Aronson 1989, Enomaa et al. 1992). Das AGA-Gen ist in der Chromosomen-Region 4q32-33 definiert und umfasst 10668 Basenpaare.Mutationen des AGA-Gens führen zur lysosomalen Speicherkrankheit Aspartylglukosaminurie (kurz: AGU). Diese Krankheit wird durch eine eingeschränkte Aktivität von AGA verursacht. Die Vererbung erfolgt meist monogen und autosomal rezessiv. AGU tritt vor allem in der finnischen Bevölkerung auf, wo die Inzidenz bei 1: 16000 liegt. Die eingeschränkte AGA-Aktivität führt zur Akkumulation von Glycoasparaginen in den Lysosomen. Dies führt zu einem Phänotyp mit progressiver geistiger Behinderung, groben Gesichtszügen sowie skelettalen und bindegewebigen Abnormalitäten. Außerdem sind erhöhte Mengen von Glykoasparaginen im Urin nachzuweisen. Die durchschnittliche Lebenserwartung liegt bei 35 - 40 Jahren. Die AGUFin-major-Mutation repräsentiert ca. 98% der finnischen AGU-Allele. Diese Mutation führt zu einem Aminosäureaustausch (C163S) im AGA-Polypeptid.In dieser Doktorarbeit habe ich mich mit der AGU-Punktmutation T122K, bei der Threonin gegen Lysin in der Alpha-Untereinheit ausgetauscht ist, beschäftigt. Meine Ziele waren: Die Klonierung von Wildtyp und T122K-AGA in verschiedene Expressionsplasmide, die Lokalisation von AGA mit Hilfe von Immunfluoreszenz-Färbungen, die AGA - Expression und Prozessierung sowie AGA-Aktivitätsmessungen.Nach Klonierung und Transfektion von AGA-Wildtyp und AGA-T122K wurde bewiesen, dass das mutierte AGA nicht prozessiert wird, während sich die Vorstufe von AGA ansammelt. Dasselbe Ergebnis wurde mit Hilfe von Patienten-Haut-Fibroblasten gezeigt. Das T122K-AGA wurde in den Lysosomen lokalisiert. Die AGA-Aktivitätsmessungen haben aufgezeigt, dass AGA-T122K eine geringere AGA-Aktivität als die Wildtypen besitzt (ca. 10%). Aspartylglucosaminidase (AGA) is a lysosomal hydrolase that participates in glycoprotein breakdown. It catalyzes the cleavage of N-glycosidic bonds between asparagine and N-acetylglucosamine. AGA is synthesized as an inactive precursor molecule that has 346 amino acids. It is rapidly cleaved into alpha and beta subunits. AGA is autoproteolytically activated by dimerization of two inactive precursor molecules. The active AGA is a tetrameric molecule that is transported to lysosomes by the mannose-6-phosphate pathway (Tikkanen et al. 1995, 1997). Wildtype AGA is very heat-stable and resistant to denaturation by SDS (Tollersrud und Aronson 1989, Enomaa et al. 1992). The location of the AGA gene was defined to 4q32-33 and spans 10668 bp.Mutations in the AGA-gene lead to a lysosomal storage disease, aspartylglucosaminuria (in short: AGU), which is caused by a deficient activity of AGA. The mode of heritage is monogenic and autosomal recessive. AGU is enriched in the Finnish population where the disease incidence is 1: 16 000. The lack of AGA activity causes accumulation of glycoasparagines in lysosomes, resulting in a phenotype with progressive mental retardation, coarse facial features, and skeletal and connective tissue abnormalities. In addition, glycoasparagines are excreted in the urine. The life expectancy is 35 - 40 years. The AGUfin-major-mutation represents 98% of all Finnish disease alleles. This mutation causes an amino acid replacement (C163S) in the AGA polypeptide.In this project, I have worked with the point mutation T122K, where threonine is substituted by lysine in the alpha-subunit. My aims of this project were: Cloning of wildtype and T122K-AGA into different expression plasmids, analysis of the localization of endogenous and transfected AGA by immunofluorescence staining, the AGA expression and processing and the AGA activity measurements.After cloning of AGA wildtype and AGA-mutation-T122K and transfection into different cell lines, it could be shown that the mutated AGA is not processed, while there is accumulation of precursor AGA. The same result was shown in patient skin fibroblasts. From the immunofluorescence stainings it was concluded that AGA-T122K is transported into lysosomes. The AGA activity measurements showed that AGA-T122K patients have less AGA activity (about 10%) than the control persons with two wildtype alleles.