TGF-beta impairs alveolar protein clearance through downregulation of the endocytic receptor megalin in alveolar epithelial cells

Abstract

The acute respiratory distress syndrome (ARDS) is a severe clinical condition characterized by impaired gas exchange due to inflammation and disruption of the alveolar-capillary barrier, which leads to accumulation of protein-rich edema into the alveolar space exacerbating the damage and reducing survival. The ability to remove excess proteins from the distal airways has been associated with positive prognosis; however, there are no effective pharmacological approaches able to facilitate alveolar protein clearance. For this reason, further research is necessary in order to shed light on the molecular mechanisms responsible of regulating the pathogenesis and resolution of ARDS.Here we provide evidence that transforming growth factor-beta (TGF-beta), a key regulator of the pathogenesis of ARDS, significantly impairs alveolar protein clearance by downregulation of the endocytic receptor megalin in alveolar epithelial cells. Megalin function was found to be critical for maintenance of homeostasis in many organs where negative effects of TGF-beta on megalin function have been described. However, the exact mechanisms underlying TGF-beta-dependent megalin downregulation remain unclear. Our data suggest that TGF-beta induces rapid megalin endocytosis and subsequently promotes its degradation in an ubiquitin-proteasome-dependent manner. Furthermore, prolonged exposition to this cytokine promotes megalin ectodomain shedding and intramembrane proteolysis of the remaining fragment, resulting in the release of a soluble variant of megalin c-terminal tail that translocates into the nucleus and regulates gene expression, including repression of its own mRNA transcription. We also demonstrate that TGF-beta-induced megalin shedding and regulated intramembrane proteolysis requires protein kinase C and gamma-secretase activities; as well as regulation of the expression, activity and localization of matrix-metalloproteases (MMPs)-2, -9 and -14. Remarkably, we propose for the first time MMP-2 and MMP-14 as novel sheddases of megalin.Short- and long-term effects of TGF-beta on megalin downregulation significantly contribute to the impairment of alveolar protein clearance, which impairs the healing of the alveolar-capillary barrier and restoration of proper lung function. Understanding how to interfere with the molecular mechanisms underlying TGF-beta-induced megalin downregulation may, thus, hold a therapeutic promise. Das akute Atemnotsyndrom (ARDS) ist eine schwerwiegende klinische Erkrankung und wird durch einen beeinträchtigten Gasaustausch charakterisiert. Diese Beeinträchtigung entsteht durch eine Entzündung und Störung der alveolar-kapillaren Barriere, welches zu einer Ansammlung eines proteinreichen Ödems in den Alveolen führt, was somit die Beschädigung am Gewebe exazerbiert und die Überlebenschance des Patienten reduziert. Die Fähigkeit überschüssige Proteine aus dem distalen Luftraum zu beseitigen wurde zwar mit einer positiven Prognose assoziiert, dennoch gibt es weiterhin keine pharmakologischen Ansätze, die eine Clearance der Proteine aus den Alveolen beschleunigt. Aus diesem Grund sind weitere Studien im Hinblick auf die molekularen Mechanismen, die für die Regulation der Pathogenese und der Lösung des akuten Atemnotsyndroms, dringend notwendig.Wir weisen nach, dass der transformierende Wachstumsfaktor ß (TGF-ß) - welcher eine Schlüsselrolle in der Pathogenese des ARDS spielt signifikant die Clearance der Proteine durch das Herunterregulieren des endozytischen Rezeptor Megalin in den alveolären Epithelzellen beeinträchtigt. Es wurde bereits beschrieben, dass Megalin eine entscheidende Rolle in der Aufrechterhaltung der Homöostase vieler Organe hat, in denen TGF-ß negativ darauf einwirkte. Jedoch bleibt der zugrundeliegende Mechanismus der Herunteregulierung des TGF-ß abhängigen Megalin unklar. Unsere Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass TGF-ß eine beschleunigte Endozytose des Megalin induziert und infolgedessen wird es durch das Ubiquitin-Proteasome-System in eine Degradierung befördert. Außerdem begünstigt eine verlängerte Exposition des Zytokins eine Abspaltung der Megalinektodomäne und eine intramembrane Proteolyse der verbleibenden Fragmente. Daraus resultiert die Freisetzung einer löslichen Variante des c-terminalen Megalinendes, welches dann in den Nukleus eindringt, somit die Genexpression reguliert und zusätzlich seine eigene mRNA Transkription hemmt. Ebenfalls konnten wir darlegen, dass die TGF-ß induzierte Megalin Abspaltung und die regulierte intramembrane Proteolyse das Protein Kinase C, die Aktivität der γ-Sekretase, und die Regulation der Expression, Aktivität sowie Lokalisation der Matrix-Metalloprotease (MMPs) -2, -9 und 14 benötigt. Wir haben somit MMP-2 und MMP-14 als Sheddasen von Megalin identifiziert.Kurz- und Langzeiteffekte des TGF-ß auf die Herunterregulierung des Megalins trägt signifikant zu einer Minderung des alveolären Proteinabtransportes bei, was die Heilung und Wiederherstellung einer normalen Lungenfunktion verhindert. Somit könnte die Interferenz mit den molekularen Mechanismen, die der TGF-ß induzierten Megalin Herunterregulation zugrunde liegen, einen therapeutischen Ansatz aufweisen.