Enzym- und immunhistochemische Analysen des zellulären Knochenmetabolismus bei der Osteoporoseinduktion im Tiermodell

Abstract

Die Osteoporose gewinnt in der alternden Gesellschaft zunehmend an Bedeutung. Die Erkrankung ist gekennzeichnet durch einen unausgewogenen Knochenmetabolismus. Ziel dieser tierexperimentellen Studie war es, die Unterschiede im Knochenmetabolismus im osteoporotischen Knochenstatus der Ratte zu definieren, indem sowohl die zelluläre Aktivität als auch die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix analysiert werden sollte. Es wurden 14 Wochen alte weibliche Sprague-Dawley Ratten verwendet. Die Osteoporoseinduktion erfolgte aus einer Kombination von Multidefizienzdiät mit bilateraler Ovarektomie (OVX+Diät) zur Untersuchung einer postmenopausalen und senilen Osteoporose. Die histologische Auswertung wurde 0M, 1M, 3M, 12M und 14M (M=Monate, n=6 pro Standzeit je Gruppe) nach Osteoporoseinduktion durchgeführt. Als Kontrolle wurden Sham-operierte Ratten verwendet. Weiterhin erhielten einige weitere Tiere Steroidgaben kombiniert mit Ovarektomie (OVX+Steroid) zur Untersuchung einer steroidinduzierten Osteoporose. Diese Ratten wurden nach 3M euthanasiert und die histologischen Ergebnisse mit denen der postmenopausalen bzw. senilen Osteoporose verglichen. Um die Osteoblasten- und Osteoklastenaktivität nachzuweisen, wurden die alkalische Phosphatase und TRAP enzymhistochemisch gefärbt sowie knochenanabole und katabole EZM-Proteine immunhistochemisch dargestellt. Die histomorphometrische Auswertung erfolgte mithilfe der Bildbearbeitungssoftwares ImageJ und GIMP, indem die Trabekeloberfläche, die gefärbte Oberfläche sowie die gefärbten Zellen analysiert wurden. Die ALP-Färbung zeigte nach 3M und 14M in der Gruppe OVX+Diät einen signifikant höheren Anteil der gefärbten Oberfläche pro Trabekeloberfläche als in der Sham-Gruppe und somit eine erhöhte Osteoblastenaktivität, während nach 12 Monaten kein Unterschied zwischen den Gruppen bestand. Bei der Steroidgruppe wurde ein signifikanter Anstieg der Osteoblastenaktivität von 3M zu 12M beobachtet. Die TRAP-Färbung ergab zu allen Zeitpunkten einen höheren, nicht signifikanten Anteil gefärbter Oberfläche pro gesamter Trabekeloberfläche bei OVX+Diät und OVX+Steroid im Vergleich zur Sham-Gruppe, was für eine erhöhte Osteoklastenaktivität spricht. Tendenziell zeigte sich mit Zunahme der Standzeit eine Zunahme der gefärbten Oberfläche. Ein signifikanter Anstieg der Osteoklastenaktivität konnte von 3M zu 12M bei der Steroidgruppe beobachtet werden.Bei den immunhistochemischen Färbungen knochenanaboler Enzyme sah man bei OVX+Diät eine höhere Aktivität mit Zunahme der Standzeit sowie teilweise auch veränderte Lokalisationen. Im Gegensatz hierzu zeigten sich bei der Färbung knochenkataboler Enzyme kaum Aktivitätsunterschiede weder zwischen den Gruppen noch zu verschiedenen Standzeiten.Insgesamt zeigte sich bei der Diätgruppe überwiegend nach langen Standzeiten ein unausgewogener Knochenumbau, was darauf hinweist, dass eine Langzeitbehandlung notwendig ist, um eine klinisch relevante Knochenbrüchigkeit zu induzieren. Weiterhin ergaben sich aufgrund der Ergebnisse der IHC und Toluidinblaufärbung Hinweise auf einen veränderten Knochenanabolismus mit schlecht mineralisierten Trabekelbereichen bei OVX+D mit Zunahme der Standzeit. Der veränderte Knochenanabolismus mit der erhöhten Osteoblastenaktivität sowie die mindermineralisierte Knochenmatrix gelten als Kennzeichen einer Osteomalazie, die erhöhte Osteoklastenaktivität mit Zunahme der Standzeit als Kennzeichen einer Osteoporose. Da gerade bei älteren Menschen auch häufig aufgrund des weit verbreiteten Vitamin D-Mangels eine sogenannte Osteoporomalazie (Mischform aus Osteoporose und Osteomalazie) vorliegt, ist dieses Tiermodell ein durchaus realistisches Modell für die senile Osteoporose. Auch bei der Steroidgruppe sah man deutlich osteoporotische Veränderungen, sodass alle Tiermodelle als geeignete Osteoporosemodelle zur weiteren Untersuchung der Pathophysiologie und zur Austestung von Therapieoptionen sowie Optionen zur Unterstützung der Frakturheilung angesehen werden können. Osteoporosis is continually gaining in importance in our ageing society and is marked by an imbalanced bone metabolism. The goal of this animal experimental study was to define the differences in bone metabolism in the osteoporotic bone status of rats by analyzing the cellular activity as well as the composition of the extracellular matrix.14 week old female Sprague-Dawley rats were used for this purpose. The induction of osteoporosis was achieved through the combination of a multi-deficient-diet and a bilateral ovariectomy (OVX+diet) to further understanding of postmenopausal and senile osteoporosis. The histological testing was conducted 0M, 1M, 3M, 12M and 14M (M=months, n=6 animals per time point) post ovariectomy. As a control group, sham-operated rats were used. Furthermore, some animals received steroid treatment combined with ovariectomy (OVX+steroid) to induce steroid-induced osteoporosis. The latter were euthanized at 3M and the histological results compared with postmenopausal and senile osteoporosis. To identify the activity of osteoblasts and osteoclasts, the alkaline phosphatase and TRAP were stained through enzyme histochemical methods. Osteoanabolic and osteocatabolic ECM-proteins were highlighted through immunohistochemistry. For the histomorphometric analysis, the image processing software ImageJ and GIMP were used to measure the trabecular surface, the stained trabecular surface as well as the stained cells.For the OVX+diet group, the ALP-staining showed a significantly higher ratio of stained surface to overall trabecular surface at 3M and 14M compared to the sham-group and thus higher osteoblastic activity. However, after 12 months there was no observable difference between the groups. Within the steroid-group, a significant increase in osteoblastic activity was observed between 3M and 12M.The TRAP-staining resulted in a higher, non-significant proportion of stained surface to total trabecular surface in the diet- and steroid-group compared to the sham-group at each time-point, which indicates increased osteoclastic activity. In general, the stained surface increased over time. Within the steroid-group, osteoclastic activity rose significantly between 3M and 12M.The immunohistochemical staining of osteoanabolic enzymes showed increased activity at later time-points as well as diverging localization for the diet-group. Opposed to this, the staining of osteocatabolic enzymes showed almost no activity difference between groups and time-points.Overall, after longer periods of time the diet-group displayed imbalanced bone metabolism, which indicates that long-term treatment is necessary to induce a clinically relevant bone fragility. In addition, the results of the IHC and the toluidine blue staining indicated a changed bone anabolism with decreasing mineralization of trabecular bone for OVX+diet over time.The changed bone anabolism, along with increased osteoblastic activity and decreased bone mineralization, are characteristics of osteomalacia, while the increased osteoclastic activity at later time-points is typical for osteoporosis. Since especially the elderly suffer from so called osteoporomalacia (a hybrid of osteoporosis and osteomalacia) due to a common vitamin D-deficiency, this animal model is a realistic model for senile osteoporosis.The steroid-group displayed obvious osteoporotic changes as well. Therefore, all animal models in question appear to be suitable osteoporosis models to further study the pathophysiology and determine therapy options as well as methods to supplement fracture healing procedures.