Functional characterization of accessory protein 7b encoded by feline coronaviruses

Abstract

Feline infectious peritonitis (FIP) is one of the most important lethal infectious diseases of cats. The genome of Feline infectious peritonitis virus (FIPV) contains five accessory genes: 3a, 3b, 3c, 7a and 7b. Due to the lack of proper immunological tools, so far, the characterization of putative FIPV accessory proteins was limited. In this study, expression, processing, glycosylation, subcellular localization and trafficking of the accessory protein 7b was studied for the first time in FIPV-infected cells. The following results were obtained:1. Recombinant FIPV (rFIPV) expressing non-glycosylated form of 7b protein was generated using vaccinia virus-based reverse genetic system. Expression and subcellular localization of this protein in FIPV-infected cells was analyzed with Western blot and confocal microscopy using anti-7b monoclonal antibody (mAb). The data showed that the non-glycosylated form of 7b protein is not secreted but co-localizes with the Golgi apparatus. 2. To characterize the mature, glycosylated form of 7b protein, rFIPVs expressing flag-tagged 7b proteins were generated by reverse genetics. The flag tag was positioned downstream of the signalase cleavage site that was determined with N-terminal Edman sequencing. Expression and subcellular localization of the flag-tagged, mature form of 7b protein in FIPV-infected cells was investigated using Western blot and confocal microscopy with anti-flag mAb. Furthermore, the state of glycosylation of 7b protein was determined with Western blot after treatment with glycosidases. The obtained results indicated that the mature form of 7b protein is not secreted but retained in the medial/trans Golgi.3. The C-terminal KTEL motif in 7b protein was altered to investigate its influence on the protein subcellular localization in FIPV-infected cells. Recombinant FIPVs expressing flag-tagged 7b protein with modifications in the C-terminal KTEL motif were generated using reverse genetics. Expression and subcellular localization of the 7b protein with altered C-terminal KTEL motifs in FIPV-infected cells was investigated with Western blot and confocal microscopy using anti-flag mAb. Additionally, the subcellular localization and trafficking of the 7b protein with altered C-terminal motifs was analyzed after inhibition of ongoing protein synthesis. It was shown that 7b protein only with an intact C-terminal KTEL motif was retained in the Golgi apparatus. KTEL to KDEL exchange led to ER retention of the protein, while KTEV, KTE and AAAA alterations abolished Golgi retention and led to efficient secretion of 7b protein.The results of the current work provide important information on 7b protein and new insight into a Golgi retention signal that controls the trafficking of this protein in FIPV-infected cells. Further studies are required to elucidate the exact role of 7b in the coronaviral life cycle. Feline infektiöse Peritonitis (FIP) gehört zu den wichtigsten meist tödlich verlaufenden infektiösen Erkrankungen der Katze. Das FIPV Genom enthält fünf akzessorische Gene: 3a, 3b, 3c, 7a und 7b. Da keine geeigneten immunologischen Reagenzien gegen die akzessorischen Proteine zur Verfügung stehen, war die bisherige Charakterisierung dieser Proteine limitiert. In Rahmen dieser Arbeit wurden die Expression, Prozessierung, Glycosylierung, subzelluläre Lokalisierung und Transport des akzessorischen Proteins 7b zum ersten Mal in FIPV-infizierten Zellen untersucht. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:1. Rekombinantes FIPV (rFIPV), welches eine nicht-glykosylierte Form des 7b Proteins exprimiert, wurde unter Nutzung eines Vaccinia Virus-basierten revers-genetischen Systems erzeugt. Die Expression und die subzelluläre Lokalisierung dieses Proteins wurden sowohl mit Western Blot als auch mit konfokaler Mikroskopie unter Verwendung von anti-7b monoklonalem Antikörper (mAk) in FIPV-infizierten Zellen analysiert. Die erhaltenen Daten zeigten, dass die nicht-glykosylierte Form von 7b Protein nicht sezerniert wird und mit dem Golgi-Apparat kolokalisiert.2. Zur Charakterisierung der glykosylierten Form des 7b Proteins wurden rFIPVs, die das 7b Protein mit Flag-Tag exprimieren, mit Hilfe eines revers-genetischen Systems erzeugt. Der Flag-Tag wurde stromabwärts der Signalase-Spaltstelle positioniert, welche mittels N-terminaler Edman-Sequenzierung bestimmt wurde. Die Expression und die subzelluläre Lokalisierung der Flag-Tag-markierten, glykosylierten Form des 7b Proteins wurden unter Verwendung von Western Blot und konfokaler Mikroskopie mit anti-Flag mAk in FIPV-infizierten Zellen untersucht. Weiterhin wurde der Glycosylierungszustanddes 7b Proteins nach Behandlung mit Glycosidasen mittels Western Blot ermittelt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die glykosylierte Form von 7b nicht sezerniert, sondern in dem medial/trans Golgi-Apparat zurückgehalten wird.3. Um den Einfluss des C-terminalen KTEL-Motivs auf die subzelluläre Lokalisation von 7b in FIPV-infizierten Zellen zu untersuchen, wurde diese Sequenz verändert. Rekombinante FIPVs, die ein Flag-Tag-markiertes 7b Protein mit Modifikationen im C-terminalen KTEL-Motiv exprimieren, wurden unter Nutzung reverser Genetik erzeugt. Die Expression und die subzelluläre Lokalisation des 7b Proteins mit veränderten C-terminalen KTEL-Motiven wurden mit Western Blot und konfokaler Mikroskopie unter Verwendung von anti-Flag mAk in FIPV-infizierten Zellen untersucht. Weiterhin wurden die subzelluläre Lokalisierung und der Transport von 7b Protein mit veränderten C-terminalen Motiven nach Inhibierung der fortlaufenden Proteinsynthese analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass 7b Protein nur mit einem intakten C-terminalen KTEL-Motiv im Golgi-Apparat zurückgehalten wird. KTEL-zu-KDEL-Austausch führte zur ER-Retention des Proteins, während KTEV-, KTE- und AAAA-Veränderungen die Golgi-Retention aufhoben und zu einer effizienten Sekretion des 7b Proteins führten.Die präsentierten Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern wichtige Informationen über 7b und ein neues Golgi-Retentionssignal, welches den subzellulären Transport von diesem Protein in FIPV-infizierten Zellen bestimmt. Weitere Versuche sind nötig, um die genaue Funktion von 7b in dem coronaviralen Lebenszyklus zu erforschen.