Die Rolle von p38 und des TNF-Rezeptors I bei der TNFalpha-induzierten Apoptose CD4+ T-Lymphozyten

Abstract

Für das Immunsystem ist es von immenser Bedeutung seine Abläufe streng zu regulieren. Auf Antigenkontakt sollte eine starke Stimulierung gefolgt von einer Inflammation stattfinden, während überschießende oder autoimmune Reaktionen eingebremst werden müssen. Eine Schlüsselrolle fällt dabei dem Zytokin TNFa zu, welches Zelltod wie auch proliferation auslösen kann und dessen Effekte unter anderem von der MAPK p38 mitreguliert werden. Die genauen Mechanismen, durch welche über das Schicksal der einzelnen Zelle entschieden wird, blieben bisher noch zu großen Teilen unbekannt.Zu diesem Zweck wurde in dieser Arbeit im Rahmen eines Zellkulturprojekts anhand von Jurkat-Zellen das Apoptoseverhalten CD4+ T-Lymphozyten unter dem Einfluss steigender TNFa-Konzentrationen und der Inhibition von p38 untersucht. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf die Lokalisation des TNFR1 gelegt, da dessen Signal auf verschiedene Art und Weise, wie die Rezeptorendozytose oder dem Rezeptorshedding, posttranslational modifiziert werden kann. Die Ergebnisse in der FACS-Analyse zeigten, dass nach 24 h sowie nach 48 h, die Apoptoserate der Zellen unter steigenden Konzentrationen an TNFa anstieg. Die im Western-Blot bestimmten Gesamtproteinmengen der apoptoserelevanten Proteine cFlip, cleaved PARP, (cleaved) Caspase 3, Caspase 8 und Caspase 9 sowie die in der RT-PCR semiquantitativ gemessene cDNA kodierend für Caspase 8 und cFlip welche zuvor aus den zugehörigen mRNA Sequenzen revers transkribiert wurden, zeigten keine signifikanten Veränderungen. Ein 24 h nach Stimulation durchgeführter LDH-Assay konnte den Einfluss von Zytotoxizität ausschließen, während im Proliferationsassay WST-1 eine Abnahme der Zellviabilität beobachtet werden konnte. Die in der FACS-Analyse gemessene Dichte des an Zelloberfläche exprimierten TNFR1 nach 24 h beziehungsweise 48 h nahm TNFa-konzentrationsabhängig ab, während die im Western-Blot bestimmte Proteinmenge des Rezeptors konstant blieb. Mit Hilfe eines ELISA konnte die Konzentration des löslichen Anteils des TNFR1, der sTNFR1, im Medium quantifiziert werden. Dabei gab ergab sich folgendes Bild: bei Stimulationskonzentrationen unter 100 ng/mL kam es zu einer nahezu Verdreifachung des sTNFR1 im Medium nach 24 h, während höhere Stimulationen mit TNFa zu einer erneuten Reduktion der Konzentration des gelösten Rezeptors führten. Die beobachteten Ergebnisse wurden durch die Inhibition von p38 durch SB253080 nicht beeinflusst. Diese Arbeit konnte somit einen Hinweis auf einen TNFa-konzentrationsabhängigen Regulationsmechanismus des TNFR1-Signalweges liefern. Dieser könnte in der Pathogenese von Erkrankungen des Immunsystems, auch im Sinne von Autoimmunerkrankungen, eine Rolle spielen. A very important task of the human immune system is the regulation of its own processes. When confronted by antigen, it should be stimulated and lead to an inflammation, while overreactions, even reactions against the own bodystructures, have to be prevented as good as possible. One of the key-cytokines taking a role in this part, is TNF-a, which can be a stimulus for cell-proliferation and death and whose signal is mediated among others by p38. Though being investigated in a lot of researches before, many of the exact mechanisms, leading to either one of the destinies of the cell, still remain unknown. Therefore, it was the aim of this dissertation to illuminate the behavior in apoptosis of CD4+ t-lymphocytes under the influence of increasing stimulations by TNFa and the inhibition of p38 by using Jurkat-cells in a cell culture project. Moreover, this work was especially focused on the localization of the TNFR1 since its signaling can be affected by posttranslational modification, for instance receptorendocytosis or receptorshedding. The results of the FACS-analysis showed that the rate of apoptosis measured after 24 h and 48 h was raised, although the Jurkat-cells proved themselves as relatively resistant against TNFa-induced apoptosis. The level of apoptosis-relevant proteins in the cells, such as cFlip, cleaved PARP, (cleaved) caspase 3, caspase 8 and caspase 9 that were analyzed by Western-Blots, did not indicate a significant change. In conclusion, the amount of cDNA encoding for cFlip and caspase 8 which were reverse transcripted from the corresponding mRNA sequences stayed on a constant rate. Cytoxicity was excluded by a LDH-assay performed 24 h after stimulation, while a slight but significant reduction of the proliferation rate was observed by using the proliferation-assay WST-1. The density of the TNFR1 on the surface of the cells measured by FACS showed a reduction of 50 % in a TNFa-concentration dependent manner after 24 h or 48 h, while the total amount of the receptor registered by Western-Bot always stayed the same. The concentration of the soluble TNFR1 the so called sTNFR1 was quantified by an ELISA kit after 24 h and delivered the following results: After stimulations with concentrations below 100 ng/mL of TNF-a the level of the sTNFR1 almost tripled, whereas concentrations above 100 ng/mL lead to a reduction of its rate again. The inhibition of p38 by SB253080 had no effect on all the observations that were made. These findings could give us one more notion about the regulation mechanisms of TNFR1-signaling, which can also be part of the pathogenesis of diseases concerning the immune system including autoimmune disorders.