Anpassung des Stoffwechsels und der Atmungskettenfunktionen in pulmonalarteriellen Gefäßmuskelzellen unter chronischer Hypoxie : insbesondere unter Betrachtung der Cytochrom-c-Oxidase Untereinheit 4 Isoform 2

Abstract

Im Rahmen der Pathogenese der pulmonalarteriellen Hypertonie (PAH) kommt es zu einem Gefäß-remodeling und zu Proliferation von pulmonalerteriellen glatten Muskelzellen (PAGMZ). Mitochondrien spielen hierbei eine wichtige Rolle in der Krankheitsentwicklung, da sie zentrale Funktionen in der Regulation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), Calciumhomöostase und Apoptose einnehmen. Nicht zuletzt bildet der mitochondriale Citratzyklus die Drehscheibe des Zellstoffwechsels, und die Atmungskette fungiert als Hauptproduzent von Adenosintriphosphat (ATP).Das Ziel dieser Arbeit war, im Modell der Hypoxie-induzierten PAH Veränderungen der mitochondrialen Atmung zwischen Kontrollzellen und hypoxisch inkubierten Zellen aufzudecken. Dazu wurden isolierte PAGMZ 24 und 48 Stunden mit 1% oder 7% Sauerstofff (O2) hypoxisch inkubiert. Daneben wurden die O2-Affinität und die Atmung an einzelnen Komplexenzymen der Atmungskette untersucht. Ergänzend erfolgte die Analyse der messenger Ribonukelinsäure(mRNA)-Menge von verschiedenen Proteinen der Atmungskette, des Zellstoffwechsels und des mitochondrialen ROS-Stoffwechsels. Die Messungen erfolgten dabei nach 12, 24 und 48 Stunden. Schließlich sollte in dieser Studie untersucht werden, ob eine pharmakologische Intervention mit Dichloroacetat (DCA) Hypoxie-induzierten Veränderungen der Atmung und der Transkiption vorbeugen kann.Es konnte gezeigt werden, dass eine chronische Hypoxieexposition von 1% O2 zu einer verminderten Atmung und zu einer verminderten O2-Affinität in PAGMZ führt. Bei 7% O2 war lediglich die Atmung reduziert. Die Aktivität von Cytochrom-c-Oxidase (Cox) war nur nach chronischer Hypoxieexposition von 1% O2 herabgesetzt.Nach chronischer Hypoxieexposition fanden sich zahlreiche Veränderungen der mRNA-Menge, so waren Glucose Transporter (GLUT) 1 und Lactatdehydrogenase (LDH) a als Vertreter des Zellstoffwechsels erhöht. Succinatdehydrogense (SDH) d, Cox8b und insbesondere Cox4i2 waren ebenfalls teils hochsignifikant hochreguliert. Ferner zeigte sich eine Erhöhung der mRNA-Menge von Superoxid-Dismutase (SOD) 2 als Protein des ROS-Stoffewechsels. Der Apoptose-Marker p66 SH2 containing proto-oncogene (SHC) war verringert exprimiert.Die Proteinkonzentration des bedeutenden Isoenzyms 2 von Cox4 war nach Hypoxieexposition erhöht.Nach Gabe des Pyruvatdehydrogenase-Kinase (PDK) 1-Inhibitors DCA konnte der hypoxische Effekt auf Cox, aber nicht auf die Respiration inhibiert werden. Durch Gabe von DCA konnte die mRNA von LDHa im Vergleich zu alleinig hypoxisch inkubierten Zellen weiter gesteigert werden. Die mRNA von PDK1, Cox4i2 und Cox8b war verringert. Zusammenfassend könnte DCA somit über eine Reduktion des Laktatspiegels einen antiproliferativen Effekt aufweisen, den man möglicherweise therapeutisch nutzen könnte. Vascular remodeling and cellproliferation are part of the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension (PAH). Mitochondria play an important role in disease development, due to their important functions in the regulation of reactive oxygen species (ROS), calcium homeostasis and apoptosis. Last but not least, the mitochondrial tricarboxylic acid cycle forms the hub in cell metabolism and the electron transport chain (ETC) acts as the main producer of adenosine triphosphate (ATP). The aim of this study was to elucidate the hypoxia-induced changes in mitochondrial respiration between normoxic control cells and hypoxic incubated cells with help of a modell of the hypoxia-induced PAH. For this purpose, isolated pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMC) were incubates in 1% or 7% oxygen (O2) for 24 and for 48 hours. In addition, the O2 affinity and the respiration of defined complex enzymes of the ETC were investigated. Complementary, the analysis of the messenger ribonucleic acid (mRNA) amount of various proteins of the ETC, the cell metabolism and the mitochondrial ROS metabolism took place. The measurements were carried out after 12, 24 and 48 hours. Finally, this study aimed to investigate whether pharmacological intervention with dichloroacetate (DCA) can prevent hypoxia-induced changes in respiration and mRNA amount. It could be shown that chronic exposure to hypoxia of 1% O2 leads to reduced respiration and reduced O2 affinity in PASMC. At 7% O2, only respiration was reduced. The activity of cytochrome-c-oxidase (Cox) was reduced only after chronic exposure to 1% O2. After chronic exposure to hypoxia, there were numerous changes in the amount of mRNA, so were glucose transporter (GLUT) 1 and lactate dehydrogenase (LDH) a, as representatives of the cell metabolism increased. Succinate dehydrogenase (SDH) d, Cox8b an especially Cox4i2 were also highly regulated. Furthermore, there was an increase in the amount of mRNA of superoxide dismutase (SOD) 2, as a protein of the ROS metabolism. The apoptosis marker p66 SH2 containing proto-oncogene (SHC) was decreased.The protein concentration of Cox4i2 was increased after exposure to hypoxia. After administration of the pyruvate dehydrogenase kinase (PDK) 1 inhibitor DCA, the hypoxic effect on Cox but not on the respiration could be inhibited. By administration of DCA, the mRNA of LDHa could be further increased in comparison to hypoxically incubated cells alone. The mRNA of PDK1, Cox4i2 and Cox8b was reduced. In conclusion, DCA could have an antiproliferative effect via a reduction of the lactate level that could possibily be used therapeutically.