On-Slide Selektion zur Generierung spezifischer Antikörper gegen akute myeloische Leukämie mit Hilfe der Phage-Display-Technologie

Abstract

Die Heilungsrate der akuten myeloischen Leukämie (AML) im Patientenkollektiv der über 60-Jährigen beträgt trotz intensiver Chemotherapie bis dato weniger als 10 %. Alternativen zu herkömmlichen onkologischen Therapiekonzepten, die eine effizientere Therapie sowie höhere Spezifität und eine damit einhergehende geringere Toxizität versprechen, steigen daher in ihrer Relevanz. Besonders die Therapie mit monoklonalen Antikörpern im Rahmen einer onkologischen Immuntherapie, vermag den vorgestellten Anforderungen an eine effektive und zielgerichtete AML-Therapie gerecht zu werden. Die AML wird als polygenetische und polymorphe Erkrankung mit aktuell noch unbekannten Oberflächenmolekülen charakterisiert, weshalb sie eine aussichtsreiche Basis für die Entwicklung einer antikörperbasierten Immuntherapie bietet. Das Ziel vorliegender Arbeit ist die Generierung AML-spezifischer Antikörperfragmente mit Hilfe der Phage-Display-Technologie. Diese stellt die aktuell erfolgreichste Methode zur Herstellung rekombinanter Antikörper in vitro dar. Durch eine neu in unserer Arbeitsgruppe etablierte Methode, die On-Slide Selektion direkt auf Formalin-fixiertem in Paraffin-eingebettetem Patientenmaterial (Knochenmarkstanzen eines an AML-erkrankten Patienten, n=1), wurden aus den semi-synthetischen, humanen scFv-Antikörpergenbibliotheken Tomlinson I und J AML-relevante Binder isoliert. Die On-Slide Selektion beinhaltet neben dem Vorteil auf nativen Antigenen direkt in ihrem physiologischen Gewebeverbund zu selektionieren, auch einen geringeren Vorbereitungsaufwand des Ausgangsmaterials im Vergleich zu standardisierten Selektionsverfahren. Als Ausgangsmaterial dienten archivierte Beckenkammtrepanate, die zur routinemäßigen Diagnosestellung AML-Patienten entnommen wurden. Es gelang, vier scFv-Antikörper zu isolieren, deren funktionale Bindeaffinität mittels ELISA und durchflusszytometrischen Analysen auf Zellen der AML-Zelllinie Kasumi-1 nachgewiesen werden konnte. In weiteren Charakterisierungsschritten mit drei selektionierten Antikörpern konnte eine Bindeaktivität auf ex vivo Materialen (FFPE-Gewebe, AML-Knochenmarksstanzen) in der Immunhistochemie und in der Immunfluoreszenz ebenfalls bestätigt werden. Diese aussichtsreichen Resultate lassen auf einen potentiell diagnostischen und therapeutischen Einsatz der selektionierten Antikörper nach einer erfolgreichen Antigenidentifikation, sowie auf eine generelle Etablierung der On-Slide Selektion zur Generierung spezifischer Antikörper gegen jedes beliebige Antigen hoffen. Despite intensive chemotherapy, the cure rate of acute myeloid leukemia (AML) within the patient group of 60-year-olds amounts to less than 10 % up to this date. Alternative methods to conventional oncologic therapy concepts, which promise a more efficient therapy as well as a higher specifity and as a consequence thereof a lower toxicity, thus rise in relevance. In particular, the therapy with monoclonal antibodies in the context of an oncologic immunotherapy assures to meet the requirements of an effective and targeted AML therapy. AML is characterized as a polygenetic and polymorphic disease with to this date yet unknown surface markers, which is why it provides a basis with good prospects for the development of an antibody-based therapy.This study s aim is the generation of AML specific antibody fragments. This is going to be achieved with the help of the phage display technology, which currently constitutes the most successful and prosperous method for producing recombinant antibodies in vitro. Our study group has established a new method, referred to as on-slide selection. This procedure operates through a selection directly on formalin-fixed in paraffin- embedded (FFPE) patient material (n=1). Thereby, AML relevant antibodies were isolated from the semi-synthetic, human scFv antibody libraries Tomlinson I and J. The on-slide selection has not only the advantage of selecting on native antigens directly in their native environment, but also requires only little preparation expenses compared to standardized selection processes. Bone marrow tissues, extracted from AML patients for the purpose of routinely making diagnoses, served as the base material. Four scFv antibodies, whose functional binding affinity could be verified through ELISA and flow cytometry on cells of a human acute myeloid leukemia cell line (Kasumi-1), were isolated. In further steps of characterizing three selected antibodies, a binding activity on ex vivo material (FFPE tissue, AML bone marrow tissue) in immunohistochemistry and immunofluorescence could be attested as well. These promising results therefore not only endorse a potential diagnostic and therapeutic application of the selected antibodies, after successful antigen identification, but also fuel hopes of a general establishment of the on-slide selection in order to generate specific antibodies against any arbitrary antigen.