Entwicklung eines Systems zur Kontrolle des Vascular Endothelial Growth Factor Spiegels im Auge

Abstract

Neovaskuläre Erkrankungen des Auges basieren auf einer hypoxieinduzierten Hochregulation der VEGF Expression. Die Therapie besteht deswegen in der intraokulären Injektion von sogenannten Anti-VEGF Molekülen die das VEGF binden und somit eine Interaktion und Aktivierung mit dessen Rezeptoren verhindern.In dieser Arbeit sollte ein System zur regulierbaren Expression von Anti-VEGF Molekülen nach viralem Adeno-assoziierten Gentransfer generiert und in vitro charakterisiert werden. Ein System zur regulierbaren Anti-VEGF Expression von den Zellen des Auges würde wiederholte intraokuläre Injektionen und die damit verbundenen Probleme vermeiden. Des Weiteren sollte ein in vivo kompatibles Messsystem zur Quantifikation von VEGF im Auge hergestellt und in vitro charakterisiert werden.Es wurde ein Anti-VEGF Fab Fragment und unterschiedliche scFab Fragmente generiert und biologisch charakterisiert. Das Fab Fragment und die kürzeste, aktivste scFab Molekülvariante wurden unter die Kontrolle des TetOn Systems gestellt. Die scFab Expressionskassette wurde in AAV (Adenoassoziierter Virus) verpackt. Die durch das Tetracyclinderivat Doxycyclin regulierbare Expression wurde nach Plasmidtransfektion und AAV Transduktion verifiziert. Es konnte erfolgreich ein Anti-VEGF Molekül reguliert als scFab Fragment nach AAV vermitteltem Gentransfer exprimiert werden das VEGF inhibierende Eigenschaften aufweist. Es kann potentiell als Therapeutikum genutzt werden um nach einmaliger subretinaler Injektion und AAV Transduktion von Photorezeptoren und RPE nur durch die orale Gabe von Doxycyclin das Anti-VEGF Molekül gezielt exprimiert zu können.Das bereits charakterisierte scFab Fragment wurde dazu benutzt um proteinbasierte Biosensoren auf dem Prinzip des Biolumineszenz Resonanz Energie Transfers (BRET) herzustellen. Die Expression wurde verifiziert und die Quantifikation von VEGF in vitro überprüft. Es konnte so eine auf BRET basierende VEGF Biosensorvariante hergestellt und charakterisiert werden mit der eine sensitive Quantifikation von VEGF möglich ist. Da es sich bei dem Biosensor um ein exprimierbares Protein handelt kann er potentiell in vivo zum Beispiel verankert auf der Oberfläche von Zellen in implantierbaren Systemen verwendet werden. Neovascular disorders of the eye are caused through a hypoxia induced upregulation of VEGF expression. These disorders are treated with repeated intraocular injections of so called Anti-VEGF molecules. These molecules are binding to VEGF so that an interaction with its receptors is inhibited. In this work a system for the regulated expression of the Anti-VEGF molecule Ranibizumab after adeno-associated gene transfer should be generated and characterized in vitro. This system would reduce the repeated injections of Anti-VEGF molecules into the eye used in neovascular diseases and the side effects caused through the therapy. Furthermore an in vivo compatible quantification system to measure the VEGF concentration in vivo should be generated and characterized.One Anti-VEGF Fab Fragment and different scFab Fragments were generated and characterized. The shortest, most active scFab molecule variant was cloned under the control of the TetOn system. The expression construct was packed into an AAV (adeno-associates virus). The doxycycline inducible expression was further verified after plasmid transfection and AAV transduction. The generated Anti-VEGF molecule shows inhibitory activity in the assays used in this dissertation. The expression of the scFab Anti-VEGF molecule could be regulated after AAV mediated gene transfer. It can be used potentially as a therapeutic agent to treat neovascular diseases after a single subretinal injection an AAV transduction. The photoreceptors and the RPE as targeted cells in the eye would be able to express the Anti-VEGF molecule after the induction of transgene expression with oral doxycycline.The well characterized scFab Fragment was used to generate protein based biosensors on the principle of the bioluminescence resonance energy transfer (BRET). VEGF is inducing a conformational rearrangement of the biosensor which changes the energy transfer and can be used to quantify VEGF. The expression of the biosensors was verified and the quantification of VEGF was checked in vitro.Furthermore a BRET based VEGF biosensor could be generated and characterized in this work that allows a sensitive quantification of VEGF in vitro. As an expressed protein the biosensor is potentially applicable in vivo for example anchored on cell surfaces which are immobilized in transplantable systems.