Characterization and fate of lipofibroblasts during lung development and fibrosis

Abstract

As of today, lipofibroblasts remain as one of the most ill-defined cell populations is the lung. They are part of the lung mesenchyme and contain lipid droplets. Since they are located near alveolar epithelial type II cells, they shuttle the accumulated lipid droplets into AECII cells and support them with surfactant production. Our data revealed that lipofibroblasts start to emerge at E16.5 which is around the time that AECIIs start to appear. FGF10 acts in an autocrine and paracrine fashion on mesenchymal and epithelial cells which are crucial for the formation of LIFs and AECIIs. In the next step we have provided evidence regarding the contribution of lipofibroblasts to the pool of activated myofibroblasts during progression of fibrosis. In brief LIFs transdifferentiate to activated myofibroblasts due to hyperactivity of TGFbeta1 signaling. Following the fate of these cells, our lineage tracing using AdrpCre-ERT2; tdTomatoflox mouse line, confirmed that during resolution phase, activated myofibroblasts, which were resulted from transdifferentiation of lipofibroblasts, revert back to their original status. Activation of PPARg signaling via treatment of cells with rosiglitazone negated the effects of TGFbeta1 treatment and enforced the lipogenic phenotype in the pulmonary fibroblasts. Following this concept, we hypothesized that treatment of the fibrotic lungs with reagents which activate PPARg signaling and enforce lipogenic phenotype in the activated myofibroblasts would yield beneficial effects for the patients. However, since rosiglitazone might not be the best choice due to increased risk of ischemic heart failure in the patients, we set the journey to find other antidiabetic drugs which would manipulate the cellular metabolism of activated myofibroblasts in the favor of lipofibroblasts. Thus, we decided to investigate the potential of metformin in conducting such effects. Treatment of pulmonary fibroblasts with TGFbeta1 (forcefully transdifferentiating them to activated myofibroblasts) followed by metformin resulted in efficient suppression of TGFbeta1 signaling and transdifferentiation to lipofibroblasts. To better mimic the in vivo situation, we cultured fresh PCLSs from human IPF patients and treated them with metformin. The results showed obvious improvement of tissue architecture, reduction of COL1A1 and increasing number of lipofibroblasts. The same readouts were also confirmed via treatment of bleomycin injured ACTA2-CreERT2, tdTomatoflox mice starting at 14 d.p.i. for the next 14 days. Metformin is a well-known agonist of AMPK. While, our data showed that metformin reduces expression of COL1A1 in an AMPK-dependent manner, induction of lipogenic markers such as PLIN2 and PPARg via metformin treatment were independent of AMPK. To explore the molecular mechanism behind this event, the transcriptome of fibroblasts treated with metformin for 72 h was analyzed. KEGG analysis revealed that in addition to alteration of many of the metabolic pathways in favor of inducing lipid droplets, BMP2 was expressed in much higher levels compared to control group. Treatment of fibroblasts with BMP2 induced expression of lipogenic markers and accumulation of lipid droplets. However, BMP2 treatment was not enough to reduce expression of COL1A1. Post translational modification analysis of PPARg following BMP2 or metformin treatment, illustrated a significant increase in PPARg phosphorylation at Ser-112. Hence, metformin suppresses expression of COL1A1 through activation of AMPK, in parallel to induction of lipogenic markers via BMP2-PPARg axis. Nach dem heutigen Stand der Wissenschaft, gehören die Lipofibroblasten (LIF) zu den wenig untersuchten Zellpopulationen der Lunge. Sie sind ein Bestandteil des Mesenchyms und enthalten lipidhaltige Vesikel. Aufgrund ihrer Nähe zu den Alveolareptihelzellen Typ II (AECII), transferieren sie die akkumulierten lipidhaltigen Vesikel zu den AECII Zellen und unterstützen diese damit in der Surfactantproduktion. Unsere Daten zeigten, dass die terminale Differenzierung der Lipofibroblasten am Embryonaltag 16.5 (E16.5) stattfindet, zu dem Zeitpunkt, wo die AECII erstmals in Erscheinung treten. FGF10 wirkt in einer autokrinen und parakrinen Weise auf die mesenchymalen und epithelialen Zellen, die für die Entstehung von LIFs und AECs II essentiell sind. Im nächsten Schritt, haben wir Beweise dafür, dass die Lipofibroblasten während der Fibroseenstehung einen entscheidenden Anteil an der Population der aktivierten Myofibroblasten beitragen. Kurz gefasst, transdifferenzieren die LIFs aufgrund einer Hyperaktivität von TGFbeta1 Signalweg zu aktivierten Myofibroblasten. Mit Hilfe der AdrpCre-ERT2; tdTomatoflox Mauslinie verfolgten wir die Veränderungen der LIFs während der Fibroserückbildung. Wir konnten feststellen, dass die aktivierten Myofibroblasten, die durch Transdifferenzierung der LIFs entstanden sind, sich wieder in ihren Urpsrungsstatus des LIFs zurückbildeten. Die Aktivierung des PPARg Signalweges durch Behandlung der Zellen mit Rosiglitazone hebt den Effekt der TGFbeta1 Behandlung auf und verstärkt den lipogenen Phänotyp der pulmonalen Fibroblasten.Wir verfolgten dieses Konzept und stellten die Hypothese, dass eine Behandlung der fibrotischen Lunge mit Reagenzien, die den PPARg Signalweg aktivieren und den lipogenen Phänotyp in aktivierten Myofibroblasten forcieren, zu einem positiven Effekt für die Patienten führen könnten. Da Rosiglitazone jedoch ein erhöhtes Risiko für ischämisches Herzversagen darstellt, suchten wir nach anderen antidiabetischen Arzneimitteln, die den Zellmetabolismus der aktivierten Myofibroblasten zugunsten der Lipofibroblasten verändern. Infolgedessen, untersuchten wir Metformin im Hinblick auf diese Effekte. Die Behandlung von pulmonalen Fibroblasten mit TGFbeta1 führt zwingend zur Transdifferenzierung dieser zu aktivierten Myofibroblasten. Eine anschließende Behandlung mit Metformin resultiert in einer effizienten Suppression des TGFbeta1 Signalweges und eine Transdifferenzierung der aktivierten Myofibroblasten zu Lipofibroblasten. Um die Situation in humanen Lungen zu simulieren, wurden frisch kultivierte Lungenschnitte (precision cut lung slices = PCLS) von Patienten mit idiopathische Pulmonalfibrose (IPF) mit Metformin behandelt. Dies führte zu einer Verbesserung der pumonalen Mikrostruktur, Reduktion von COL1A1 und Zunahme der Lipofibroblasten. Dieselben Ergebnisse erzielten wir, als wir mit Bleomycin behandelte Mäuse der Linie ACTA2Cre-ERT2; tdTomatoflox, 14 Tage nach Bleomycin Gabe für 14 Tage mit Metformin behandelten. Metformin ist ein bekannter Agonist von AMPK. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Metformin über einen AMPK-abhängigen Mechanismus die Expression von COL1A1 reduziert. Andererseits ist die Induktion von lipogenen Marker wie PLIN2 und PPARg durch Metformin unabhängig von AMPK. Um den zu Grunde liegenden Mechanismus zu verstehen, wurden die Transkriptome der Fibroblasten 72 h nach Behandlung mit Metformin untersucht. KEGG Analysen zeigten neben der Aktivierung von vielen metabolischen Pathways zur Induktion von lipidhaltigen Vesikeln, eine deutlich erhöhte Expression von BMP2 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Eine Behandlung von Fibroblasten mit BMP2 induziert Expression von lipogenen Markern und führt zur Akkumulation von lipighaltigen Vesikeln. Jedoch führte BMP2 nicht zur reduzierten Expression von COL1A1. Eine posttranslationale Analyse von PPARg nach Behandlung mit BMP2 oder Metformin, zeigte einen drastischen Anstieg von Ser-112 in PPARg, die zu einer höheren Aktivierung des Proteins führt. Infolgedessen schlußfolgern wir, dass Metformin über die Aktivierung von AMPK die Expression von COL1A1 unterdrückt, während sie parallel die lipogenen Marker über die BMP2-PPARg Achse induziert.