Zur Rolle des hypoxischen Tumor-Mikromilieus in anti-angiogener Resistenz

Abstract

Anti-angiogene Tumortherapie konnte in vielen Studien bereits als eine äußerst wirksame Therapieform dargestellt werden und hat bereits Einzug in den klinischen Alltag gehalten. Widererwartend findet auch bei dieser Therapieform, die Tumorzellen nicht direkt angreift, eine Resistenzbildung statt. Eine klinische Herausforderung ist die evasive Resistenz, die sich durch verstärkte Metastasenbildung auszeichnet. Ziel dieser Arbeit war es, dem Mechanismus dieser evasiven Resistenzbildung nachzugehen, um etwaige Therapieansätze verbessern zu können und das Risiko der Resistenzbildung zu minimieren.Dazu wurden in vivo Mäuse, die einen humanen Brustkrebstumor trugen, anti-angiogen mit Sunitinib behandelt und nach Ende der Therapie die Tumorzellen isoliert. Während der Therapie wurde mittels IVIS die Ausprägung der Hypoxie in den Tumoren gemessen. Parallel dazu wurde in vitro die gleiche Brustkrebszelllinie wechselnden Zuständen der Hypoxie mit anschließender Reoxygenierung (intermittierende Hypoxie) ausgesetzt. Beide Zelllinien wurden anschließend molekularbiologisch mittels Western Blot, quantitativer PCR und Zellkulturassays charakterisiert.Im Einklang mit den vorherigen Studien entwickelten die anti-angiogen behandelten Mäuse signifikant mehr Metastasen. Kongruent dazu zeigten die Tumorzellen, die aus behandelten Tumoren reisoliert wurden, einen invasiveren Phänotyp. Er zeichnete sich vor allem durch die verstärkte Expression von HIF-2alpha, die vermehrte Invasion im modifiziertem Boyden-Chamber-Assay und einem erhöhtem Tumorstammzell-Phänotyp aus. In Analysen der IVIS-Aufnahmen zeigten sich verstärkt hypoxische Zustände in den behandelten Tumoren. Passend dazu konnte ein analoger Phänotyp in dem in vitro erzeugten Modell ausschließlich durch intermittierende Hypoxie nachgestellt werden. Durch ein knock-down von HIF-2alpha mittels shRNA konnte HIF-2alpha als treibende Kraft der verstärkten Invasivität herausgestellt werden. Nach Analysen der Schlüsselenzyme der DNA-Demethylierung wurde in einem Überexpressionsmodell TET1 als möglicher Auslöser des Phänotypwechsels identifiziert.Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass Hypoxie im Tumormikromilieu, ausgelöst durch anti-angiogene Therapie, mittels TET1 vermittelter DNA-Demethylierung und verstärkter HIF-2alpha Expression einen Phänotypwechsel in den Tumorzellen auslöst und somit die Grundlage zur Resistenzbildung schafft. Eine Inhibition dieses Phänotypwechsels könnte die Resistenzbildung auf anti-angiogene Therapie vermindern sowie die klinische Ansprechraten erhöhen. Several studies proved anti-angiogenic therapy to be effective against several types of cancer and it already found its way into clinical practice. Although this therapy does not target tumor cells directly, tumors develop anti-angiogenic resistances. In particular the evasive resistance, which is characterized by the increased formation of metastases, is clinically challenging. The aim of this work was to investigate the mechanism of the evasive resistance to further improve anti-angiogenic therapy and counteract the development of resistance.For this purpose, nude mice with human breast carcinoma xenograft, recived antiangiogenic treatment with Sunitinib. During the treatment the animals were imaged using the IVIS to monitor the development of hypoxia. Following the therapy tumor cells were isolated for cell culture. In parallel the same breast carcinoma cell line was exposed to repeated cycles of hypoxia and re-oxygenation (intermittent hypoxia). Both lines were extensively characterized using Western blot, quantitative PCR and cell culture assays.In line with previous studies anti-angiogenic treated mice suffered from increased metastasis formation. Importantly, isolated tumorcells from treated animals presented a more invasive phenotype. The phenotype was characterized by the increased expression of HIF-2alpha, enhanced invasion in the modified Boyden-Chamber-Assay and increased cancer stem cell phenotype. The IVIS-imaging proved that anti-angiogenic treated tumors exhibited increased hypoxia. Interestingly, an analogous phenotype was reproduced in cell lines exposed to intermittent hypoxia. Mechanistically, using a knock down of HIF-2alpha via shRNA, we could show that HIF-2alpha is responsible for the increased invasive behavior of tumor cells. Following the analysis of key enzymes involved in DNAmethylation we could identify TET1 as a possible regulator of the phenotypic switch triggered by anti-angiogenic treatment or intermittent hypoxia.The results of this thesis suggest that hypoxia in the tumormicroenviroment, which is caused by anti-angiogenic therapy, leads to a phenotypic switch caused by increased DNA-demethylation and HIF-2alpha expression. From a therapeutic point of view, the inhibition of this switch could be an interesting avenue to to mitigate evasive resistance and improve the therapeutic outcome of anti.angiogenic therapy.