Einzelzell-basierte Analyse der endogenen Protein-Protein-Interaktion von p65 mit IkBalpha, DCP1a oder LMO7 mittels Proximity Ligation Assay
| dc.contributor.author | Schlereth, Eva Barbara | |
| dc.date.accessioned | 2023-03-16T20:19:28Z | |
| dc.date.available | 2020-03-16T14:23:10Z | |
| dc.date.available | 2023-03-16T20:19:28Z | |
| dc.date.issued | 2018 | |
| dc.identifier.uri | http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-149649 | |
| dc.identifier.uri | https://jlupub.ub.uni-giessen.de//handle/jlupub/15369 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-14751 | |
| dc.description.abstract | Protein-Protein-Interaktionen sind essentiell für die Regulation intrazellulärer Prozesse. Ein prominentes Beispiel hierfür ist die Interaktion der p65 Untereinheit der NFkB Transkriptionsfaktoren mit seinem inhibitorischen Partnerprotein IkBalpha. Diese stabile Interaktion führt dazu, dass p65 in unstimulierten Zellen im Zytoplasma retiniert wird. Die Stimulation der Zelle mit dem pro-inflammatorischen Zytokin IL-1alpha führt zum proteasomalen Abbau von IkBalpha, wodurch p65 für den Eintritt in den Zellkern und zur Genexpression frei gegeben wird. Obwohl die sequentiellen Interaktionen der Proteine innerhalb der NFkB-Signalkaskade relativ gut etabliert sind, gibt es nur wenige Methoden, um deren Vorkommen auf Einzelzell-Ebene zu untersuchen. In dieser Dissertation wurde der auf Einzelzell-Analyse basierende Proximity Ligation Assay (PLA) als eine neue Methode evaluiert, um bereits bekannte und neue Interaktoren von p65 auf dem endogenen Proteinlevel zu quantifizieren und visualisieren. Um die Fähigkeit des PLA zu testen, physiologisch relevante Protein-Protein-Komplexen abzubilden, wurde die IL-1alpha-abhängige Regulation des p65/IkBalpha-Komplexes untersucht und mit den Ergebnissen aus klassischen Ko-Immunopräzipitations-Experimenten verglichen. Diese Ergebnisse zeigten, dass es möglich ist mit dem PLA die transiente Reduktion der p65/IkBalpha-Komplexe während einer IL-1alpha-Stimulation abzubilden. Die Spezifität des PLA wurde zum einen durch Experimente bestätigt, bei welchen Zellen eingesetzt wurden, in denen p65 nicht exprimiert wurde und zum anderen durch pharmakologische Hemmung von TAK1, einem upstream-Aktivator des p65/IkBalpha-Komplexes. Außerdem wurde der PLA nicht nur zur Detektion von Protein-Protein-Interaktionen genutzt, sondern auch um die Expression und Phosphorylierung einzelner Proteine zu quantifizieren. Diese Eigenschaft des PLA wurde verwendet, um die Verteilung und die subzelluläre Lokalisation von p65, Phospho-p65 und des mRNA-decay Faktors DCP1a in einzelnen Zellen abzubilden. Außerdem konnte mit Hilfe des PLA eine neue Interaktion von endogenem p65 mit endogenem DCP1a, einem entscheidendem Faktor des decapping-Komplexes, nachgewiesen werden. Die PLA Signale für diese Interaktion waren spezifisch, da sie nicht nachzuweisen waren, wenn in den Zellen kein p65 bzw. DCP1a exprimiert wurde. Der p65/DCP1a-Komplex wurde hierbei nicht durch IL-1alpha reguliert. Des Weiteren gelang der Nachweis einer bisher unbekannten Interaktion des LMO7-Proteins mit p65, deren Spezifität ebenfalls mittels Zellen, welche aufgrund eines knock downs, kein p65 exprimierten, nachgewiesen werden konnte. Im Gegensatz zu DCP1a, ging die Anzahl der p65/LMO7-Interaktionen unter Stimulation mit IL-1alpha zurück.Insgesamt zeigten die Ergebnisse, welche in dieser Dissertation erarbeitet wurden, dass der PLA eine zuverlässige Methode für den Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen des NFkB-Signalwegs unter Stimulation mit Zytokinen, darstellt. Ein weiterer Vorteil des PLA ist die Möglichkeit Protein-Protein-Interaktionen auf der Einzelzell-Ebene und deren subzelluläre Lokalisation mit hoher Auflösung untersuchen zu können. | de_DE |
| dc.description.abstract | Protein:protein interactions are essential for regulating intracellular processes. A prominent example is the interaction of the p65 subunit of the transcription factor NFkB, with its inhibitory partner protein IkBalpha. This stable interaction leads to cytoplasmic retention of p65 in untreated cells. Stimulation of cells with the proinflammatory cytokine IL-1alpha triggers the proteasomal destruction of IkBalpha thus liberating p65 for nuclear entry and regulation of gene expression. Although the sequential interactions of proteins within the NFkB signaling cascade are well established, assays allowing their determination in single cells are rarely available. In this dissertation, the single cell based proximity ligation assay (PLA) was evaluated as a new method for quantifying and visualizing known and new interactors of p65 at the endogenous protein level. To test the ability of the PLA to recapitualte physiological relevant formation of protein:protein complexes, the IL-1alpha-dependent regulation of the p65/IkBalpha complex was investigated and compared to classical co-immunoprecipitation experiments. These results showed that it was possible to determine a transient decrease in p65/IkBalpha complexes upon IL-1alpha stimulation. The specifity of the PLA was confirmed in cells lacking p65 or by pharmacological inhibition of TAK1, an upstream activator of the p65/IkBalpha complex. Besides determining protein:protein complexes, the PLA was also used to quantify the protein expression and phosphorylation levels of single proteins. This feature was used to monitor the distribution and subcellular localisation of p65, phospho-p65 and the mRNA decay factor DCP1a in individual cells. Furthermore we could show by PLA a novel interaction of endoenous p65 with endogenous DCP1a, an essential component of the decapping complex. The PLA signals for this interaction were specific, as they were absent in cells lacking p65 or DCP1a. The p65/DCP1a complex was not regulated by IL-1alpha. Moreover we found a previously unknown interaction of the LMO7 protein with p65, whose specifity was also validated by including cells with knock down of p65. Unlike DCP1a the p65/LMO7 interaction decreased upon IL-1alpha treatment. Collectively, the results obtained in this thesis reveal the PLA as a reliable method for the detection of protein:protein interactions occuring within the NFkB signaling pathway of cytokine-activated cells. An additional advantage of PLA is the possibility to examine protein:protein interactions within single cells and to investigate their subcellular localization at high resolution. | en |
| dc.language.iso | de_DE | de_DE |
| dc.rights | In Copyright | * |
| dc.rights.uri | http://rightsstatements.org/page/InC/1.0/ | * |
| dc.subject.ddc | ddc:610 | de_DE |
| dc.title | Einzelzell-basierte Analyse der endogenen Protein-Protein-Interaktion von p65 mit IkBalpha, DCP1a oder LMO7 mittels Proximity Ligation Assay | de_DE |
| dc.type | doctoralThesis | de_DE |
| dcterms.dateAccepted | 2019-11-14 | |
| local.affiliation | FB 11 - Medizin | de_DE |
| thesis.level | thesis.doctoral | de_DE |
| local.opus.id | 14964 | |
| local.opus.institute | Rudolf-Buchheim-Institut für Pharmakologie | de_DE |
| local.opus.fachgebiet | Medizin | de_DE |
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