Extrazelluläre RNA (eRNA) als Alarmsignal in der angeborenen Immunität : Charakterisierung der Freisetzung von eRNA aus Mastzellen

Abstract

Extrazelluläre RNA (eRNA) wurde bereits als ein neues Alarmsignal im Rahmen der angeborenen Immunität gewertet und als potenter Stimulator der Zytokinfreisetzung bei Monozyten und Makrophagen beschrieben.Um die Bedeutung von extrazellulärer RNA in der Entzündungsreaktion weiter zu untersuchen, wurde die Freisetzung aus Mastzellen mittels verschiedener Methoden charakterisiert. Verschiedene Stimuli einschließlich Ionomycin, C48/80, C3a sowie C5a und weitere waren in der Lage Mastzellen zu stimulieren und eine eRNA-Freisetzung zu induzierten. Dabei korrelierte die Menge an freigesetzter RNA mit dem Ausmaß der Degranulierung. Zusätzlich wurde durch die Hemmung der Degranulierung mittels Cromolyn (Mastzellstabilisator), Wortmannin (Hemmstoff der PI3-Kinase) und BAPTA (Calciumchelator) die RNA-Freisetzung reduziert.Der Großteil der freigesetzte RNA konnte in der Mikropartikel-Fraktion der Mastzellen nachgewiesen werden, die mittels Zentrifugation aus den Zellüberständen isoliert wurde. Eine Analyse der freigesetzten RNA mittels Gelelektrophorese zeigte, dass es sich hierbei um 18s und 28s rRNA handelt.Mit Hilfe von Immunfluoreszenzfärbungen wurde die Lokalisation im Inneren der Mastzelle untersucht. Durch Verwendung von Antikörpern gegen ribosomale RNA und ribosomale Proteine konnte eine Ko-Lokalisation der RNA mit ribosomalen Proteinen im Zytosol aber außerhalb der Mastzellgranula gezeigt werden. Tryptase fungierte als Marker der Mastzellgranula und zeigte keine Ko-Lokalisation mit RNA. Zusätzlich konnte keine Ko-Lokalisation von intrazellulärer RNA mit dem Membranprotein CD46 gezeigt werden, welches die zytoplasmatische Lokalisation der rRNA bestätigt. Die Elektronenmikroskopbilder, die mit Hilfe eines Gold-Antikörpers gegen RNA angefertigt wurden, untermauerten ebenfalls diese These.Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ribosomale RNA (in Assoziation mit Mikropartikeln) im Verlauf der Stimulation und Degranulation von Mastzellen freigesetzt wird. Dieser Prozess könnte an der Stimulation von Zellen der angeborenen Immunität beteiligt sein und daher inflammatorische Prozesse beeinflussen. Self-extracellular RNA (eRNA) is considered to be a new alarm signal in innate immunity and was described as potent stimulator of cytokine release in monocytes/macrophages. In order to evaluate the importance of eRNA in association with inflammatory reactions, mast cells were characterized for liberation of eRNA using different methodological approaches. Various stimuli, including Ionomycin, C48/80, complement C3a and C5a and others were able to promote mast cell stimulation, accompanied by the release of eRNA, whereby the quantity of liberated eRNA correlated well with the degree of mast cell degranulation. In addition, inhibition of degranulation by Cromolyn (mast cell stabilizer), Wortmannin (inhibitor of PI3-kinases) or BAPTA (calcium chelator) reduced the extent of eRNA liberation. Interestingly, after mast cell stimulation, the majority of eRNA was found in association with microparticles that were isolated by centrifugation from cell supernantents. Following gel electrophoretic analysis of extracted eRNA, the characteristic 18S/28S pattern of ribosomal RNA was discernable. Inside mast cells, immunofluorescence staining using antibodies against ribosomal RNA and ribosomal proteins revealed their co-localisation in the cytosol but outside mast cell granules, which stained positive for e.g. tryptase. Additional no co-localisation of intracellular RNA with CD46 could be demonstrated. Finally, electron microscopical inspection using collodial gold-labeling against the indicated components underlined these findings. Together, these studies characterize ribosomal RNA (in association with microparticels) as the predominant component of eRNA, being released upon mast cell stimulation and degranulation. Subsequently, this eRNA serves as potent stimulator of immune cells for robust induction of various cytokines in the context of inflammatory processes.