Atypische cholinerge Agonisten am Kolonepithel

Abstract

Das Kolonepithel produziert ACh, welches freigesetzt wird, nachdem die kurzkettige Fettsäure Propionat an G-Protein gekoppelte Rezeptoren bindet. ACh wiederum induziert über cholinerge Rezeptoren eine epitheliale Anionensekretion. Das Schlüsselenzym der Acetylcholinsynthese, die Cholineacetyltransferase, verestert Cholin unselektiv mit kurzkettigen Fettsäuren. Da über die bakterielle Fermentation das Kolonepithel permanent hohen Konzentrationen von verschiedenen kurzkettigen Fettsäuren ausgesetzt ist, stellte sich die Frage, ob auch andere Cholinester (also nicht nur ACh) wie PCh oder BCh am Kolonepithel produziert werden. In der Folge war zu untersuchen, ob diese atypischen Ester ebenfalls cholinerge Rezeptoren stimulieren, was wiederum eine Anionensekretion bewirkt.Experimentelles Vorgehen: Desorption electrospray ionization mass spectroscopy (DESI-MS) und Ussing-Kammer-Versuche wurden an Mucosa-Präparaten des distalen Rattenkolons durchgeführt. Zusätzlich wurden zur Darstellung der intrazellulären Calciumkonzentration Fura-2-Messungen an Kolonkrypten durchgeführt.Ergebnisse: Die Analyse mit der DESI-MS bestätigte das physiologische Vorkommen von ACh, PCh und BCh. In der Ussing-Kammer bewirkten beide atypischen Cholinester über die Stimulation einer Anionensekretion einen konzentrationsabhängigen Anstieg des Kurzschlussstroms. Die Versuche mit Blockern wurden an Mucosa-Präparaten ohne Submucosa durchgeführt, um den Einfluss der Somata sekretomotorischer Neuronen des Plexus submucosus zu verringern und die Wirkung der Cholinester hauptsächlich auf die Rezeptoren direkt an den Epithelzellen zu beschränken. Im Gegensatz zu BCh, welches nikotinerge und muskarinerge Rezeptoren stimulierte, wirkte PCh überwiegend an muskarinergen Rezeptoren. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen eine Co-Stimulation beider Rezeptortypen nahe, die sich gegenseitig in ihrer Wirkung potenzieren. Dies konnte auch mit Ca2+-Imaging mit BCh bestätigt werden. In weiteren Ussing-Kammer-Versuchen wurde als Ursache für die Erhöhung des Isc eine Ca2+-abhängige Cl--Sekretion nachgewiesen.Schlussfolgerung und Ausblick: Diese Ergebnisse weisen auf einen Signalübertragungsweg hin, der der Kommunikation zwischen den Darmmikroben und dem Wirt dient, welche kurzkettige Fettsäuren produzieren. Hierbei wird über die epitheliale Produktion von Cholinestern das Kolonepithel parakrin beeinflusst. Hier stellt sich die Frage wie man den modulierenden Einfluss der atypischen Cholinester in der Therapie bzw. Prophylaxe von Diarrhö anwenden könnte. The colonic surface epithelium produces acetylcholine, which is released after binding of propionate to G-protein coupled receptors for this short-chain fatty acid (SCFA). The consequence is the induction of epithelial anion secretion via stimulation of cholinergic receptors by epithelial acetylcholine. The key enzyme responsible for acetylcholine synthesis, choline acetyltransferase, is known to be unselective concerning the fatty acid used for esterification of choline. The colonic epithelium is permanently exposed to high concentrations of different SCFA, which are produced by bacterial fermentation. In this thesis the question was asked whether choline esters other than acetylcholine, i.e. propionylcholine or butyrylcholine, are produced by the colonic epithelium, too, and whether these atypical´ esters are able to stimulate cholinergic receptors involved in the regulation of colonic ion transport.Experimental approach: Desorption electrospray ionization mass spectroscopy (DESI-MS) and Ussing chamber experiments were performed at the mucosa of the distal colon of the rat. In addition the signal from Fura-2 in Ca2+-imaging experiments was measured.Key results: DESI-MS analyses revealed the production of acetylcholine, propionylcholine and butyrylcholine in the colonic surface epithelium. In Ussing chamber experiments, both atypical choline esters caused a concentration-dependent increase in short-circuit current, i.e. stimulated epithelial anion secretion. Inhibitor experiments in the absence of the submucosal plexus revealed mainly the stimulation of epithelial cholinergic receptors. While butyrylcholine obviously stimulated both nicotinic and muscarinic receptors, propionylcholine predominantly stimulated muscarinic receptors. Overadditve actions of antagonists for muscarinic and nicotinic suggest a co-stimulation of both receptor types at level of the epithelium. Ca2+-imaging experiments with butyrylcholine directly confirmed this conclusion a co-stimulation. Additional Ussing chamber experiments revealed that the increase in short-circuit current is caused by a secretion of chloride, which is modulated by the intracellular calcium concentration.Conclusions and Implications: These results suggest a novel pathway for communication between intestinal microbes producing SCFA and the host. This communication is mediated via modification of epithelial production of choline esters involved in the paracrine regulation of the colonic epithelium. Thus the question arises how the modulating effect of atypical choline esters could be used in therapy or prophylaxis of diarrhea.