Identifikation der Interaktionsdomäne von Galektin-8 und K-Ras4B sowie der Einfluss von Galektin-8 auf Ras-abhängige Signalwege in Tumorzellen

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2020

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-14806

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Die vier Ras-Isoformen H-Ras, N-Ras, K-Ras4A sowie K-Ras4B gehören zur Familie der Ras-Proteine. Diese Membran-assoziierten monomeren GTPasen wechseln zwischen einem GTP-gebundenen, aktiven und einem GDP-gebundenen, inaktivem Zustand. Das aktive GTP-gebundene Ras-Protein vermittelt an der Plasmamembran eine Aktivierung von Effektorproteinen, die über verschiedene Signalwege Proliferation, Migration, Differenzierung, Überleben und Transformation von Zellen beeinflussen. Die intrinsische und die durch GTPase-aktivierende-Proteine(GAP)-vermittelte GTPase Aktivität von Ras liegt in vielen bekannten, onkogenen Ras-Mutanten stark reduziert vor, sodass Ras im GTP-gebundenen Zustand an der Plasmamembran verbleibt und dort unkontrolliert Effektor-Signalwege aktiviert. In Pankreas- und Lungenkarzinomen liegt das KRAS-Onkogen prädominant mutiert vor. Versuche, onkogenes K-Ras zu inhibieren oder die Lokalisation von K-Ras zu verändern waren aufgrund der Toxizität bzw. Ineffektivität der pharmakologischen Inhibitoren erfolglos. Galektin-8 wurde in unserer Arbeitsgruppe als ein neuer Interaktionspartner von K-Ras4B beschrieben. In früheren Analysen konnte die N-terminale carbohydrate recognition domain (CRD) von Galektin-8 bereits als interagierende Domäne mit K-Ras identifiziert werden. Um die Bedeutung der Farnesylierung von K-Ras4B für die Interaktion mit Galektin-8 zu analysieren, wurden Farnesyldomänen-Mutanten von K-Ras4B ektop exprimiert und in vitro-Interaktionsstudien mit endogenem Galektin-8 aus PANC-1-Lysaten durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass farnesyl-defizientes K-Ras4B nicht mit Galektin-8 interagiert. Weiterhin wurde der Einfluss der positiv-geladenen Lysine im C-Terminus von K-Ras4B auf die Interaktion mit Galektin-8 untersucht. Lysine an den Positionen 182 bzw. 184 in der Aminosäuresequenz von K-Ras4B wurden gegen Serin bzw. Prolin ausgetauscht. Es zeigte sich, dass bei einer Mutation beider Lysine an den Positionen 182 und 184 die Interaktion mit Galektin-8 eingeschränkt ist. Werden darüber hinaus zusätzlich die Lysine innerhalb der polybasischen Domäne von K-Ras4B mutiert, so kommt es zu einem nahezu vollständigen Verlust der Interaktion der beiden Proteine. Im Gegensatz zur Interaktion von Galektin-1 und Galektin-3 mit Ras-Proteinen ist die Interaktion von Galektin-8 mit K-Ras4B unabhängig von dem gebundenen Guaninnukleotid. Weitere GTPasen, wie Rac1, Rac1b und Cdc42, die posttranslational geranylgeranyliert vorliegen, konnten in in vitro-Interaktionsstudien ebenfalls als Interaktionspartner von Galektin-8 identifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass Lysine in unmittelbarer Nähe des prenylierten Cysteins erneut einen stabilisierenden Einfluss auf die Interaktion dieser GTPasen mit Galektin-8 haben. Auf Basis dieser Erkenntnisse wurden Strukturanalysen in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Karin Fritz-Wolf (Institut für Ernährungswissenschaften, Gießen) erstellt. Es konnte eine hydrophobe Tasche innerhalb der N-CRD von Galektin-8 identifiziert werden, die ein negativ-geladenes Aminosäure-Cluster enthält, welches mit der polybasischen Domäne von K-Ras elektrostatisch interagieren und somit die Interaktion zwischen den beiden Proteinen stabilisieren könnte.Untersuchungen zu den Effekten eines siRNA-vermittelten knockdowns von Galektin-8 auf den Ras/Raf/MEK/ERK-Signalweg, zeigten, dass der Proteingehalt von EGFP-K-Ras(G12V) nach knockdown von Galektin-8 zunimmt. Ebenfalls konnte eine erhöhte Phosphorylierung von ERK1/2 nachgewiesen werden, welche durch den Anstieg des Proteingehaltes von EGFP-K-Ras(G12V) begründet sein könnte. Analysen hinsichtlich des PI3K/Akt-Signalwegs zeigten, dass nach einem knockdown von Galektin-8 der Proteingehalt von Akt sowie die Phosphorylierung von Akt verringert ist. Über Akt-Isoform-spezifische Antikörper konnte nachgewiesen werden, dass die Akt-Isoform Akt2 als einzige der drei analysierten Akt-Isoformen nach Galektin-8 knockdown reduziert vorliegt. Die Depletion von Galektin-8 führte außerdem zu einer Reduktion der Migrations- und Proliferationsrate von PANC-1-Zellen. Des Weiteren zeigten Immunfluoreszenz-Analysen, dass Galektin-8 mit K-Ras an der Plasmamembran ko-lokalisiert. Es konnte an einigen der analysierten Strukturen eine Ko-Lokalisation von Gal-8 mit Rab7 sowie eine Ko-Lokalisation von Galektin-8 mit Rab11 an Late- und Recycling-Endosomen detektiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig die direkte Interaktion von K-Ras und Galektin-8 nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass die Interaktion von K-Ras und Galektin-8 abhängig von der Farnesylierung von K-Ras, den Lysinen 182 und 184 am C-Terminus von K-Ras sowie abhängig von der polybasischen Domäne von K-Ras ist. Weiterhin konnte dargestellt werden, dass Galektin-8 die beiden bedeutenden, tumorrelevanten Signaltransduktionswege Ras/Raf/MEK/ERK sowie den PI3K/Akt beeinflusst und bei Depletion zu einer Reduktion der Migration und Proliferation von PANC-1-Zellen führt. Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Daten weisen weiterhin darauf hin, dass Galektin-8 als Chaperon-ähnliches Transportprotein K-Ras von der Plasmamembran oder von endosomalen Strukturen extrahieren und im Folgenden zur proteasomalen Degradation geleiten könnte.

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