Die Rolle des NF-kB-Signalwegs bei der Aktivierung muriner Makrophagen durch das N-terminale Fragment des kardialen Myosin-bindenden Proteins C (C0C1f)

Abstract

Die Aufklärung der grundlegenden Mechanismen bei kardiovaskulären Erkrankungen ist essenziell für die Entwicklung neuer Therapieansätze und Medikamente, um das Fortschreiten von Myokardschäden zu verhindern. Besonders die Inflammation nach Myokardinfarkt führt oftmals zu einer überschießenden Immunantwort, die in einem größeren Gewebsschaden als ursprünglich verursacht mündet. Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Zusammenhänge des cMyBP-C und der inflammatorischen Prozesse in Makrophagen aufzudecken. Um diese Mechanismen in Erfahrung zu bringen, wurden in vitro Zellkulturexperimente unter Verwendung von murinen Makrophagen herangezogen. Nach der Isolation muriner Knochenmarksstammzellen wurden diese mithilfe von M-CSF zu Makrophagen ausdifferenziert und dienten als Modell für Makrophagen des gesunden Körpers. Die Zellen wurden für Verfahren wie Western Blot, qRT-PCR, Immunhistochemie und den EMSA-ELISA Test untersucht. Das cMyBP-C ist Bestandteil des dicken Filaments im Sarkomer und gewährleistet die Interaktion zwischen Aktin und Myosin zur Kontraktion des Muskels. Unter einem Myokardinfarkt kommt es zur Spaltung des cMyBP-C. Dabei entsteht ein Teilfragment, das COClf. Durch Stimulation der Makrophagen mit COClf über verschiedene Zeiträume konnte gezeigt werden, dass konzentrationsabhängig eine proinflammatorische Antwort, auf mRNA und teilweise auch auf Proteinebene, über IL- 6, IL-1beta, TNFalpha, ICAM-l, VCAM-l und MCP-l in Makrophagen ausgelöst wurde. Weiterhin konnte über die Inhibierung von NF-kappaB unter Verwendung des Inhibitors Bay ll-7O82 verdeutlicht werden, dass die aktivierte Signalkaskade über den Mediator NF-kappaB läuft. Es zeigte sich ebenfalls ein Zusammenhang zwischen der durch COClf ausgelösten Inflammationsantwort und den Rezeptoren TLR 2, TLR 4 und RAGE. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern einen erweiterten Einblick in die intrazellulären Mechanismen in primär murinen Makrophagen nach COClf Stimulation. Bei bisher bekannten eher negativen Auswirkungen des COClf auf Kardiomyozyten könnte eine Verhinderung der cMyBP-C-Spaltung und Inhibierung der COClf-Stimulation als therapeutischer Ansatz in Frage kommen. Weiterhin gilt zu eruieren, inwieweit die Ergebnisse auch in vivo auf den menschlichen Organismus übertragbar sind, um einen möglichen therapeutischen Nutzen zu verdeutlichen. The elucidation of basic mechanisms upon cardiovascular diseases is essential for the development of novel therapeutic and medical approaches to prevent the progress of myocardial injury. Particularly the inflammation after myocardial infarction frequently leads to an excessive response of the immune system that causes larger tissue damage than initially induced by the infarction. This thesis aimed to reveal the molecular connections between the cardiac Myosin Binding Protein-C (cMyBP-C) and inflammatory processes in macrophages. In order to examine these mechanisms in vitro cell experiments with murine macrophages were performed. After the isolation of murine bone marrow stem cells, they differentiated into macrophages due to M-CSF treatment. The macrophages served as a model for macrophages of a healthy state. The cells were harvested and prepared for procedures such as western blotting, qRT-PCR, Immunochemisty and EMSA-ELISA. The cMyBP-C is part of the thick filament in the sarcomere and responsible for the interaction between actin and myosin during a muscle contraction. During myocardial infarctions the cMyBP-C undergoes a cleavage resulting in the release of a fragment called COC1f. It has been shown that COC1f stimulation of macrophages over different periods, dependent on the concentration, provoked a pro-inflammatory answer, on mRNA and partly also on protein level, showing higher levels of IL-6, IL-1beta, TNFalpha, ICAM-1,VCAM-1 and MCP-1. Furthermore, an inhibition of NF-kappaB by applying the inhibitor Bay 11-7O82 elucidated that NF-kappaB is a mediator of the activated signaling pathway. In addition, it was possible to draw a connection between the COC1f induced inflammation and the inflammatory receptors TLR2, TLR4 and RAGE.The results give further insights of the intracellular mechanism in murine macrophages stimulated by COC1f. By rather common negative effects of COC1f on cardiomyocytes a prevention of a cMyBP-C cleavage and the inhibition of a COC1f activation after myocardial infarction could possibly serve as a therapeutic approach. Furthermore, it needs to be determined to what extend those results are applicable in vivo as well as to human organisms to clarify the therapeutic benefit.