Inhibition of the JAK2-STAT3 pathway using ruxolitinib as a therapeutic option for pulmonary hypertension

Abstract

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterized by an excessive vascular remodeling, which accounts for the obliteration of the lung vasculature resulting an increase in vascular resistance and mean blood pressure in the pulmonary arteries ultimately leading to right heart failure and death. Vascular remodeling involves increased proliferation of cells in all three layers of the vessels; intimal-endothelial, medial-smooth muscle and adventitial-fibroblast cells. Deciphering the molecular details of aberrant signaling in pulmonary vascular cells in P(A)H is fundamental for the development of new therapeutic strategies. I aimed to identify tyrosine kinases as new potential drug targets that are dysregulated in PAH by means of a peptide-based kinase activity assay. I performed a tyrosine kinase dependent phosphorylation assay using 144 selected microarrayed kinase substrate peptides. The differential signature of phospho-peptides was used to predict alterations in tyrosine kinase activities in pulmonary arterial smooth muscle cells (HPASMCs) from IPAH patients compared to healthy control cells. Thereby, i observed an over-activation and an increased expression of Janus kinase 2 (Jak2) in HPASMCs from IPAH patients. In line with this finding, increased expression of Jak2 and it s downstream target Stat3 was observed in HPASMCs from IPAH patients as compared to donors. Furthermore, similar upregulation was observed in lung homogenates from MCT rats as compared to healthy rats.I demonstrated a decrease in proliferation and migration of HPASMCs from healthy individuals as well as from IPAH patients upon exposure to the FDA-approved Jak2-inhibitor ruxolitinib. In vivo experiments were performed in two established experimental models of pulmonary hypertension MCT rats and chronic hypoxia mice. I demonstrated, ruxolitinib dose-dependently attenuated elevated pulmonary arterial pressure, reduced right heart hypertrophy and restored cardiac index in hypoxia-induced PH in mice and monocrotaline-induced PAH in rats. No adverse events of ruxolitinib on cardiac function could be detected. These results suggest that ruxolitinib is a novel therapeutic agent in PAH by effectively blocking Jak2-Stat3 mediated signaling pathways. Die pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) ist durch eine abnorme Umwandlung der Pulmonalgefäße gekennzeichnet, welche für die Obliteration dieser Blutgefäße verantwortlich ist. Diese führt zu einem Anstieg des Gefäßwiderstands und des Blutdrucks in den Lungenarterien, was letztlich zur Rechtsherzinsuffizienz und dem vorzeitigen Tod führt. Die Umwandlung der Blutgefäße geht mit einer verstärkten Proliferation der Zellen in allen drei Schichten der Gefäße einher; intimal- Endothelzellen, medial- glatte Muskelzellen und adventitial- Fibroblasten. Die Entschlüsselung der molekularen Details der veränderten Signalübertragung in den Zellen der Pulmonalgefäße in der P(A)H ist essentiell für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien.Ziel dieser Arbeit war es, durch einen Peptid-basierten Kinaseaktivitätstest, in der PAH deregulierte Tyrosinkinasen als neue potenzielle Wirkstoffziele zu identifizieren. Ich habe einen Tyrosinkinase-abhängigen Phosphorylierungstest mit 144 ausgewählten, auf einem Microarray Chip fixierten Kinase-Substrat-Peptiden durchgeführt. Die unterschiedliche Signatur der Phosphopeptide wurde verwendet, um Veränderungen der Tyrosinkinaseaktivitäten in pulmonal arteriellen glatten Muskelzellen (HPASMCs) von IPAH-Patienten, im Vergleich zu gesunden Kontrollzellen, zu prognostizieren. Dabei beobachteten ich eine Überaktivierung und eine erhöhte Expression der Janus-Kinase 2 (Jak2) in HPASMCs von IPAH-Patienten. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnte eine erhöhte Expression von Jak2 und seinem nachgeschalteten Zielprotein Stat3 in HPASMCs von IPAH-Patienten, im Vergleich zu HPASMCs von gesunden Probanden, beobachtet werden. Dieselbe Hochregulation trat auch in Lungenhomogenisaten von MCT Ratten, verglichen mit gesunden Ratten, auf.Durch die Behandlung mit dem von der FDA zugelassenen Jak2 Inhibitor Ruxolitinib konnten ich eine Abnahme der Proliferation und Migration von HPASMCs von gesunden Probanden, sowie von IPAH-Patienten, zeigen. Die in vivo Experimente wurden in zwei etablierten experimentellen Modellen der pulmonalen Hypertonie durchgeführt, MCT-Ratten und chronisch hypoxischen Mäusen. Ich zeigten, dass Ruxolitinib dosisabhängig den pulmonalen arteriellen Druck verringert, die Hypertrophie des rechten Herzens reduziert und den Herzindex, in Hypoxie induzierter PH in Mäusen und in der Monocrotalin induzierten PAH in Ratten, wiederherstellt. Zudem konnten keine Nebenwirkungen von Ruxolitinib auf die Herzfunktion identifiziert werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ruxolitinib, ein neuartiges therapeutisches Mittel für die PAH ist, indem es Jak2-Stat3-vermittelte Signalwege effektiv blockiert.