Etablierung eines ELISpot-Assays zur Detektion von Antikörpern gegen Beta-3-Integrine

Abstract

HintergrundZiel der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung eines B-Zell-ELISpot-Assays (Enzyme Linked Immuno Spot Assay) zur Detektion von Antikörpern gegen beta3-Integrine. Mütterliche Antikörper gegen das humane Plättchenantigen 1a (HPA-1a) sind die häufigste Ursache der Fetalen und Neonatalen Alloimmunthrombozytopenie (FNAIT). Das Antigen HPA-1a ist durch einen Aminosäureaustausch in der beta3-Integrinkette charakterisiert. Kürzlich konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass bestimmte mütterliche anti-HPA-1a Antikörper mit fetaler Hirnblutung assoziiert sind. Diese Antikörper reagieren mit dem Vitronektin-Rezeptor (alphaV beta3-Integrin) und induzieren eine funktionelle Störung des Endothels. Dieser Subtyp von anti-HPA-1a Antikörpern wurde bei Müttern von Neugeborenen ohne Hirnblutung nicht gefunden. Bei Müttern von Neugeborenen ohne Hirnblutung wurden Antikörper nachgewiesen, die gegen den Fibrinogen-Rezeptor (alphaIIb beta3) gerichtet sind. Die beiden Antikörper-Subtypen erkennen somit die beta3-Integrin-Kette im Verbund mit einer jeweils anderen alphaKette (Verbund- abhängiger (compound-dependent) Antikörper). Ein weiterer Antikörper-Subtyp erkennt das HPA-1a Antigen auf der beta3-Integrin-Kette unabhängig von dem Verbund mit einer alpha-Kette. Da Antiseren von Müttern mit FNAIT immer ein polyklonales Gemisch zahlreicher Antikörpermoleküle repräsentieren, ist die Gewinnung und Charakterisierung von murinen und humanen monoklonalen Antikörpern für die Pathogeneseforschung, für die Entwicklung von Nachweisverfahren zur Risikostratifizierung sowie zur Entwicklung neuer Medikamente zur Prophylaxe fetaler Blutungen unverzichtbar.Mittels B-Zell-ELISpot-Assay können einzelne, Antikörper-sezernierende Zellen in einer Mikrotiterplatte in situ nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Hypothese untersucht, dass der B-Zell-ELISpot-Assay ein geeignetes Verfahren zur Charakterisierung von Hybridomzellen und damit zur Entwicklung neuer monoklonaler Antikörper gegen beta3-Integrine darstellt. In einer zweiten Phase sollte untersucht werden, ob das gleiche Nachweisverfahren auch zum quantitativen Nachweis von Antikörper- sezernierenden Zellen aus Blutproben von Patienten, und damit zur Bestimmung des Risikos einer fetalen Hirnblutung bei Schwangeren mit FNAIT, geeignet ist.MethodenIn dieser Studie wurde ein neuer B-Zell-ELISpot-Assay zur Detektion von Antikörpern gegen beta3-Integrine etabliert. Dies geschah in zwei Phasen. In Erster wurde ein ELISpot- Assay zur Testung monoklonaler Antikörper etabliert um die Sensitivität, Spezifität und Verbund-Abhängigkeit gegen beta3-Integrine zu charakterisieren. Hierfür wurden von Hybridom-Zellen sezernierte monoklonale Antikörper mittels auf einer Polyvinylidenfluorid -Membran (PVDF) fixierten Ziege-Anti-Maus-Antikörpern (GAM) gefangen. Anschließend wurden, die so immobilisierten Antikörper, mit den biotinylierten rekombinanten Integrinen alphaIIb beta3 und alphaV beta3 inkubiert. Zum Nachweis einer Antigenbindung wurde ein enzymmarkiertes Streptavidin-Substrat-System genutzt, dass eine Bindung in Form von Spots auf der Membran visualisierte. Drei Hybridomzelllinien: Gi5, Gi16 und AP3, die vorangehenden Untersuchungen als Anti- alphaIIbbeta3, Anti-alphaIIb und Anti-beta3 charakterisiert worden sind, wurden im ELISpot getestet. Als Negativkontrolle wurde eine Hybridomzelllinie (7D8) verwendet, die einen monoklonalen Antinkörper gegen CD177 produziert. In der zweiten Phase wurde dieser Assay für die Testung humaner B-Zellen weiterentwickelt. Der Aufbau des Assays blieb gleich, es wurden zur Immobilisierung sezernierter Antikörper Ziege-Anti-Human- Antikörper (GAH) verwendet. Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von NAIT und GT-Patienten wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Diese wurden für 72 Stunden in eine Stimulationskultur mit Interleukin-2 (IL-2) und dem Toll- Like-Rezeptor-Agonisten (TLR) R848 übernommen. Nach Durchführung der in vitro Stimulation wurden die Zellen mit denselben rekombinanten Proteinen wie zuvor inkubiert. Der Nachweis der Antigenbindung erfolgte mit demselben Detektionssystem.ErgebnisseNach Etablierung des Assays für monoklonale Antikörper konnte eine Intra- von 4,28% und eine Inter-Assay-Variabilität von 6,38% gemessen werden. Anschließend wurden Untersuchungen zur Sensitivität und Spezifität durchgeführt. Im Vergleich mit der Positiv-Kontrolle (Total-IgG) konnte kein signifikanter Unterschied für die Detektion monoklonaler Antikörper gegen alphaIIbbeta3 und alphaVbeta3 (Antigenspezifisches-IgG) festgestellt werden, somit konnte jeder sezernierte Antikörper nachgewiesen werden. Weiterhin konnten in einem Grenzverdünnungsversuch bis zu 15 antikörpersezernierde Zellen (ASC) unter 985 Myelomzellen detektiert werden. Die Hybridomzelllinie AP3, die einen nicht Verbund-abhängigen Antikörper gegen die beta 3-Kette produziert, reagierte mit alphaIIbbeta3 und alphaVbeta3, wohingegen es bei Gi5, einem Verbund-abhängigen (compound- dependent) Antikörper, ausschließlich zur Spotbildung mit alphaIIbbeta3 kam. Die Analyse einer dritten Hybridomzelllinie, Gi16 (anti-alphaIIb), zeigte nur wenige Spots mit alphaIIbbeta3, was darauf hinwies, dass sich verschiedene Klone in der Kultur befanden (produzierende und nicht-produzierende). Nach erneuter Klonierung der Zelllinie durch die Grenzverdünnungsmethode konnte eine signifikant erhöhte Anzahl von Spots identifiziert werden. Für den Nachweis Antikörper-sezernierender Zellen aus Blutproben von Patienten war der Assay nicht geeignet. Wir vermuten, dass unspezifische Spots durch Zell-Aggregate zwischen Antigen-präsentierenden Zellen und exogen stimulierten B-Zellen hervorgerufen wurden.SchlussfolgerungIm Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt, werden, dass der hier entwickelte B- Zell-ELISpot-Assay zum Nachweis einzelner Antikörper-sezernierender Hybridomzellen in situ geeignet ist. Der Nachweis der Antikörper-Sekretion einzelner Hybridomzellen erlaubte Rückschlüsse auf die Klonalität und Produktivität der untersuchten Zelllinien. Ferner konnte in dem etablierten B-Zell-ELISpot-Assay in situ differenziert werden, ob monoklonale Antikörper die beta3-Integrin-Kette im Verbund mit einer jeweils spezifischen alpha-Kette oder Verbund-unabhängig erkennen. Zusammenfassend gesagt, ist der B-Zell-ELISpot ein geeignetes Verfahren, monoklonale Antikörper gegen beta3-Integrine in einem frühen Stadium nach Fusion zu charakterisieren.Damit wurde eine Grundlage für die Charakterisierung humaner monoklonaler Antikörper gelegt, mit denen die Pathogenese der Hirnblutung weiter aufgeklärt werden kann und neue Medikamente zur Prophylaxe von Blutungen entwickelt werden können. BackgroundThe aim of this study is the establishment of a B cell ELISpot assay (Enzyme Linked Immuno Spot Assay) for the detection of antibodies against 3-integrins. Maternal antibodies against human platelet antigen 1a (HPA-1a) are the most common cause of fetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia (FNAIT). The antigen HPA-1a is characterized by an amino acid exchange in the beta3-integrin chain. Recently, our group has demonstrated that certain maternal anti-HPA-1a antibodies are associated with fetal brain hemorrhage. These antibodies react with the vitronectin receptor (alphaVbeta3 integrin) and induce endothelial dysfunction. This subtype of anti-HPA-1a antibody was not found in mothers of newborns without cerebral hemorrhage. Antibodies to the fibrinogen receptor (alphaIIbbeta3 integrin) were detected in mothers of newborns without cerebral hemorrhage. The two antibody subtypes thus recognize the beta3-integrin chain in complex with a different alpha-chain (compound-dependent antibodies). Another antibody subtype recognizes the HPA-1a antigen on the beta3-integrin chain independently of the complex with a alpha-chain. Since maternal bloodsera in cases of FNAIT always represent a polyclonal mixture of numerous antibody molecules, the extraction and characterization of murine and human monoclonal antibodies is indispensable for pathogenesis research, the development of detection methods for risk stratification, and the development of new drugs for the prevention of fetal bleeding.By means of the B cell ELISpot assay, individual antibody-secreting cells can be detected in situ in a microtiter plate. In the present work it was hypothesized that the B cell ELISpot assay represents a suitable method for the characterization of hybridoma cells and thus for the development of new monoclonal antibodies against beta3-integrins. In a second phase, it should be investigated whether the same detection method is also suitable for the quantitative detection of antibody-secreting cells isolated from blood samples of patients, and thus for the determination of the risk of fetal brain hemorrhage in pregnant women with FNAIT.Materials and MethodsIn this study, a new B cell ELISpot assay for the detection of antibodies against beta3- integrins was established. This happened in two phases. In the first, an ELISpot assay for monoclonal antibodies was established to characterize the sensitivity, specificity and compound dependence against beta3-integrins. For this purpose, monoclonal antibodies secreted by hybridoma cells were captured by goat-anti-mouse-antibodies (GAM) coated on a polyvinylidene fluoride membrane (PVDF). Subsequently, the immobilized monoclonal antibodies were incubated with biotinylated recombinant integrins alphaIIb beta3 and alphaVbeta3. To detect antigen binding, an enzyme-labeled streptavidin-substrate system was used that visualized binding in form of spots on the membrane. Three hybridoma cell lines: Gi5, Gi16 and AP3, which were previously characterized as anti-alphaIIbbeta3, anti-alphaIIb and anti-beta3, were tested in this assay. The negative control used was a hybridoma cell line (7D8) producing monoclonal antibodies against CD177. In the second phase, this assay was further developed for the testing of human B cells. The structure of the assay remained the same, however in this assay goat-anti-human-antibodies (GAH) were used to immobilize secreted antibodies. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with cases of NAIT and Glanzmann s thrombasthenia (GT) were isolated by density gradient centrifugation. These were transferred to cell culture plates with interleukin-2 (IL-2) and the toll-like receptor agonist (TLR) R848 for stimulation and differentiation. After in vitro stimulation, the cells were incubated with the same recombinant proteins used before with monoclonal antibodies. For detection of antigen binding the same detection system was used.ResultsAfter establishing the ELISpot for monoclonal antibodies, an intra-assay variation of 4.28% and an inter-assay variation of 6.38% were measured. Subsequently, studies on sensitivity and specificity were performed. In comparison with the positive control (Total IgG), no significant difference was found for the detection of monoclonal antibodies against alphaIIbbeta3 and alphaVbeta3 (antigen-specific IgG), which shows that any secreted Antibody was detected. In addition, up to 15 antibody secreting cells (ASC) could be detected among 985 non antibody producing myeloma cells. The hybridoma cell line AP3, which produces a non-compound-dependent antibody against the beta3 chain, reacted with alphaIIbbeta3 and alphaVbeta3, whereas Gi5, a compound-dependent antibody, only reacted with alphaIIbbeta3. Analysis of a third hybridoma cell line, Gi16 (anti-alphaIIb), showed only a few spots with alphaIIbbeta3. We hypothesized that there were different clones in cell culture (producing and non-producing). After renewed cloning of the cell line by the limiting dilution method a significantly increased number of spots could be identified. The assay was not suitable for detection of antibody-secreting cells from patient blood samples. We suspect that nonspecific spots were caused by cell aggregates between antigen presenting cells and exogenously stimulated B cells.ConclusionIn the present work it could be shown that the B-cell ELISpot assay developed here is suitable for the detection of single antibody-secreting hybridoma cells in situ. The detection of antibody secretion of individual hybridoma cells allowed conclusions about the clonality and productivity of the investigated cell lines. Furthermore, it was possible to differentiate in situ in the established B-cell ELISpot assay whether monoclonal antibodies recognize the beta3-integrin chain compound dependent with a specific alpha-chain or independently. In summary, the B cell ELISpot is a convenient method to characterize monoclonal antibodies to beta3-integrins at an early stage after fusion. This laid the groundwork for the characterization of human monoclonal antibodies, which further elucidate the pathogenesis of cerebral hemorrhage and develop new drugs for the prevention of hemorrhage.