MiR-34a regulates Migration of Mouse Lung Fibroblasts by modulating PDGFR signalling

Abstract

Bronchopulmonary dysplasia (BPD) is a chronic lung disease, which often occurs in preterm infants due to neonatal lung injury, and is defined by a lack of alveoli formation. Depending on the severity of the disease there are severe long-term consequences, such as early onset of chronic obstructive lung disease (COPD). Although a lot of progress has been made to improve the outcome of the disease, a cure has yet to be found. Therefore, it is imperative to investigate the development of BPD in order to identify new targets to improve the prognosis of the disease. In an experimental mouse model of hyperoxia induced BPD, a microarray showed an upregulation of microRNA (miR)-34a. It was also revealed, that miR-34a targets the platelet-derived growth factor receptors (PDGFR) alpha and beta, which are known to be crucial for fibroblast migration during secondary septation. Downstream signalling molecules of PDGFR alpha and beta are for example extracellular signal-regulated kinase (ERK) and AKT, also known as Protein Kinase B. In this thesis, a series of in vitro experiments including real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR), transfection, western blot analysis and migration assay, was conducted in mouse lung (MLg) fibroblasts, to investigate the effect of miR-34a on PDGFR alpha and beta and on fibroblast migration. It was revealed by qPCR analysis that hyperoxia firstly increases the level of the miR-34 family, most notably of miR-34a, and secondly reduces the expression of PDGFR alpha and beta in MLg fibroblasts. Transfecting MLg fibroblasts with miR-34a also showed a reduction of PDGFR alpha and beta levels. To further examine the effects of miR-34a on PDGFR alpha and beta, its downstream signalling molecules were investigated. Western blot analysis showed a reduced activation of downstream signalling, especially when stimulating the miR-34a transfected MLg fibroblasts with PDGFA, the specific ligand to PDGFR alpha. Furthermore, migration assays revealed reduced migration in MLg fibroblasts after miR-34a transfection, with and without stimulation of PDGFR alpha and beta with their ligands. In conclusion, these results suggest an important role of miR-34a as a negative regulator of fibroblasts migration via the PDGFR, and thus as a crucial factor in one of the mechanisms causing BPD. Therefore, further investigation of miR-34a and PDGFR interaction could contribute to a deeper understanding of BPD and ultimately improve the outcome of the disease. Bronchopulmonale Dysplasie (BPD) ist eine chronische Erkrankung der Lunge, die häufig bei Frühgeborenen auftritt, die einer künstlichen Beatmung bedürfen. Die Erkrankung ist durch einen Mangel an Alveolen charakterisiert. Abhängig vom Schweregrad der Erkrankung gibt langfristige Komplikationen, zum Beispiel frühes Einsetzen von chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD). Obwohl bereits viele Fortschritte gemacht wurden um das Outcome der Erkrankung zu verbessern, konnte diese Erkrankung bisher nicht geheilt werden. Daher ist es notwendig die Entstehung von BPD zu untersuchen, um neue Therapietargets zu identifizieren, um die Prognose der Erkrankung zu verbessern. In einem experimentellen Mausmodell mit Hyperoxie induzierter BPD, konnte eine vermehrte Expression von microRNA (miR)-34a festgestellt werden. Ferner wurde festgestellt, dass platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) alpha und beta, wichtige Moleküle für die Migration von Fibroblasten, Targets von miR-34a sind. Nachgeschaltete Signalmoleküle von PDGFR alpha und beta sind zum Beispiel extracellular regulated kinase (ERK) und AKT, auch bekannt als Protein Kinase B. In dieser Arbeit wurden mittels einer Serie von Zellversuchen an Mauslungen (MLg) Fibroblasten die Effekte von miR-34a auf PDGFR alpha und beta und auf Fibroblasten Migration untersucht. Diese Versuche beinhalteten quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), Transfektion, Western Blot Analyse und Migrationsassays. Es konnte mittels qPCR gezeigt werden, dass Hyperoxie erstens die Expression der miR-34 Familie, vor allem von miR-34a, verstärkt, und zweitens, die Expression von PDGFR alpha und beta reduziert. Eine Transfektion der MLg Fibroblasten zeigte ebenso eine Reduktion von PDGFR alpha und beta Expression. Um die Wirkung von miR-34a auf PDGFR alpha und beta tiefgründiger zu untersuchen, wurden dessen nachgeschaltete Signalmoleküle untersucht. Western Blot Analyse zeigte eine reduzierte Aktivierung dieser Signalmoleküle in mit miR-34a transfizierten MLg Fibroblasten, insbesondere in dem Fall einer Stimulation mit PDGFA, dem spezifischen Liganden für PDGFR alpha. Des Weiteren konnten mittels Migrationsassays eine reduzierte Migration der miR-34a transfizierten MLg Fibroblasten festgestellt werden, mit und ohne Stimulation von PDGFR alpha und beta mit ihren Liganden. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse auf eine wichtige Rolle von miR-34a als negativer Regulator von Fibroblasten-migration durch die PDGFR, und somit als Teil einer der Mechanismen, die die Entstehung von BPD begünstigen. Daher könnte weitere Forschung an der miR-34a und der PDGFR alpha und beta das Verständnis der Pathophysiologie von BPD vertiefen und letztlich zu einer Verbesserten Prognose der Erkrankung führen.