Der Einsatz von Granulocyte-Colony Stimulating Factor zur Behandlung der diastolischen Funktionsstörung im Mausmodell

Abstract

Trotz aller Bemühungen ist bis heute keine kurative Therapie der diastolischen Herzinsuffizienz verfügbar. Verschiedene Studien konnten zeigen, dass die Applikation von G-CSF das klinische Outcome nach Myokardinfarkt verbessern kann. Da das Wirkungsspektrum von G-CSF auf das Myokard sehr breit ist, besteht aktuell ein großes Forschungsinteresse an der Verwendung von G-CSF im Rahmen kardiovaskulärer Erkrankungen. Manche Studien berichten Erfolge, andere Studien keine Effekte bei der Verwendung von G-CSF. Hierzu steht im Widerspruch, dass Vorarbeiten von Szardien et al. gezeigt hatten, dass G-CSF in einem linksventrikulären Hypertrophie-Modell an der Maus zu einer Regression der Hypertrophie und Fibrose führt.Mit dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob sich die Behandlung mit G-CSF positiv auf das myokardiale Remodeling bei isolierter diastolischer Funktionsstörung im Mausmodell auswirkt. Zur Untersuchung des Einflusses von G-CSF auf Veränderungen der extrazellulären Matrix und auf Entzündungsprozesse wurde in einem Tiermodell an der Maus eine osmotische Mikropumpe implantiert, die durch kontinuierliche Applikation von niedrig dosiertem AngiotensinII zu einer diastolischen Funktionsstörung führt. Darüber hinaus erfolgte die Untersuchung eines möglichen Einflusses von G-CSF auf Gap Junctions im Rahmen der intraventrikulären elektromechanischen Kopplung. Der G-CSF- Gruppe wurde nach zwei beziehungsweise nach vier Wochen für sieben Tage G- CSF (300 myg/kg/KG) subkutan verabreicht, die Kontrollgruppe erhielt NaCl in selber Dosierung. Die Nach Ablauf der beiden Versuchszeiträume wurden die diastolischen Funktionsparameter (E´/A´, E/E´) mithilfe der hochauflösenden Echokardiographie validiert, und nach Euthanasierung der Tiere die Myokardproben mit immunhistologischen und molekularbiologischen (Western Blot, qRT-PCR) Verfahren untersucht.In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass G-CSF über die Verminderung des Kollagengehalts zu einer Reduktion der myokardialen Fibrose führt. Die Regression der Fibrose ist in diesem Modell nicht durch eine G-CSF-bedingte Verminderung der inflammatorischen Aktivität bedingt, da sich G-CSF in beiden Versuchszeiträumen nicht auf die klassischen Inflammationsparameter oder auf die Einwanderung inflammatorischer Zellen (Makrophagen und Neutrophile Granulozyten) auszuwirken scheint. Das signifikant erhöhte Expressionsprofil der Proteine CAMP und Lactoferrin jedoch durch eine konsekutiv verminderte Einwanderung kardialer Fibroblasten zur Reduktion der kardialen Fibrose beitragen. Der Nachweis eines signifikant erhöhten Connexin-43- Proteingehalts in der mit G-CSF behandelten Gruppe im Western Blot legt die Vermutung nahe, dass G-CSF im Rahmen der diastolischen Funktionsstörung über eine Erhöhung des Gap Junction Proteins Connexin-43 nicht nur präventiv auf die Entstehung des elektromechanischen Remodeling einwirkt, sondern im längeren Verlauf das nachfolgende Auftreten von Fibrose abschwächt. Ursächlich für die Erhöhung von Connexin-43 könnte die Erhöhung des Strukturproteins beta-Catenin sein, welches im Western Blot in der mit G-CSF behandelten Gruppe ebenfalls signifikant erhöht war. Die Ergebnisse bestätigten somit die Hypothese, dass G-CSF über Augmentation des beta-Catenin-Proteingehalts den Connexin-43-Proteingehalt erhöht, und somit wahrscheinlich zur Verbesserung der elektromechanischen Kopplung beiträgt.Die hier dargestellten Ergebnisse geben einen wichtigen Einblick in die längerfristigen adaptiven Mechanismen im Rahmen der diastolischen Funktionsstörung und bieten die Möglichkeit, den therapeutischen Einsatz von G-CSF im Rahmen der diastolischen Herzinsuffizienz zu verbessern, und so den Verlauf der Erkrankung positiv zu beeinflussen. Although HFpEF represents approximately 50% of all patients with heart failure, the mechanisms involved in the pathophysiology are still poorly understood. Furthermore, the clinical syndrome comprising heart failure symptoms is increasing in prevalence, morbidity and mortality and will reach soon epidemic proportions due to demographic change and rising comorbidities. For the clinician, it remains among the most challenging of clinical syndromes as a variety of myocardial mechanisms and the presence of common comorbidities are involved. Until now there is no effective treatment nor animal models that are not based on pressure overload.As recently demonstrated, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) has beneficial effects on the healing process and myocardial regeneration after myocardial infarction. Furthermore, G-CSF modulates the inflammatory reaction in a mouse-model of pressure overload and subsequent unloading, leading to a regression of cardiac fibrosis and a significant improvement of functional parameters.As fibrosis plays a pivotal role in the pathogenesis of HFpEF we developed an animal model for HFpEF using mice and treated these mice with G-CSF. The mouse model reflects the pathological effects of chronic infusion of low dose Angiotensin-II leading to the HFpEF phenotype and grants better insights into the pathophysiology of diastolic heart failure.We hypothesized that G-CSF prevents cardiac remodeling by decreasing myocardial collagen content and thereby leading to a regression of fibrosis. In addition, the effects of G-CSF on inflammatory processes and the electromechanical remodeling were investigated.Healthy C57BL6/J-mice received a continuous infusion of low dose Angiotensin II (AngII, 0.5myg/kg/min) via an osmotic pump. After one or four weeks, diastolic functional parameters (E´/A´, E/E ) were measured by high-resolution echocardiography. The mice were randomized in an experimental group (G-CSF 300 myg/kg BW/d) and a control group (saline). Two-time responses were examined (7d vs. 28d). Immunohistochemistry revealed increased fibrosis in the saline-treated mice whereas treatment with G-CSF led to a regression of fibrosis and decreased myocardial collagen content. Fibrosis was measured using Picrosirius Red stain.Analysis of inflammatory mediators such as neutrophils and monocytes showed no difference in cell-amount nor expression of classical cytokines. Interestingly, the expression of immunomodulatory cytokines Lactoferrin and Cathelicidin were significantly increased in G-CSF treated mice suggesting a so far unknown mechanism of G-CSF induced immunomodulation. Beyond that G-CSF led to an increased Connexin- 43-protein content subsequent to an increased amount of the signal protein beta-Catenin in Western Blotting.These findings suggest that G-CSF diminishes myocardial fibrosis by regulating inflammatory mechanisms apart from the established pathways. The regression of cardiac fibrosis leads to a prevention of gap junction remodeling that often precedes cardiac remodeling. With a better understanding about the impact of G-CSF on cardiac function one might be able to optimize the administration of G-CSF in patients with HFpEF and thus improve clinical outcome.