Entwicklung einer neuen zellbasierten Qualitätskontrolle der extrakorporalen Photopherese durch CD71-Oberflächenfärbung und Apoptosequantifizierung

Abstract

Die extrakorporale Photopherese (ECP) ist seit mehr als 30 Jahren klinisch etabliert und gilt als erfolgreiches Verfahren in der Behandlung verschiedener T-zellvermittelter Erkrankungen. Trotz jahrelanger Nutzung gibt es kein standardisiertes Protokoll für die zellbasierte Qualitätskontrolle. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zu entwickeln, das die zelluläre Reaktion nach ECP-Behandlung zeigt. T-Zellaktivierungsmarker wie CD71, CD69, CD25 und Ki-67 wurden dazu systematisch mittels Durchflusszytometrie im Hinblick auf Kinetik und Zuverlässigkeit analysiert und es wurden verschiedene T-Zellstimulanzien sowie Zellkulturbedingungen untersucht. Die Ergebnisse wurden mit dem Goldstandard der CFSE-T-Zellproliferationsmessung und der Apoptosemessung unter Verwendung von Sytox- und Annexin-V-Färbung verglichen. Untersucht wurden Proben von 11 gesunden Blutspendern und 10 ECP-Verfahren von 6 Patienten. In Vorversuchen an PBMCs gesunder Blutspender erwies sich der Oberflächenmarker CD71 als geeignet, den Photophereseeffekt in Form einer Proliferationsinhibition schnell und verlässlich nach UVA-/8-MOP-Behandlung anzuzeigen. In den folgenden Validierungsversuchen wurde die CD71-Expression nach Zellstimulation mit CD3/CD28/IL-2 bereits 16 Stunden nach der UVA/8-MOP-Behandlung wirksam unterdrückt. Die Ergebnisse konnten durch die CFSE-Färbung und -Messung bestätigt werden. In Patientenproben erwiesen sich beide Assays auf Proliferationsbasis als weniger sensibel und zeitaufwendig, wohingegen die Apoptosemessung eindeutig einen Effekt der UVA-/8-MOP-Behandlung in allen Proben zeigte. Zusammenfassend stellt die Analyse der CD71-Expression eine neuartige und einfache Qualitätskontrolle dar, um die zelluläre Proliferationsinhibierung nach Photopherese in Proben gesunder Blutspender nachzuweisen. Im klinischen Alltag wäre dieses Verfahren in der Kontrolle der Materialien- und Substanzqualität denkbar. In Patientenproben scheint die Messung der Apoptose der zuverlässigere Test zur Überprüfung von ECP-Verfahren zu sein. Extracorporeal photopheresis (ECP) has been clinically established for more than 30 years and is considered a successful method in the treatment of various T-cell mediated diseases. Despite years of use, there is no standardized protocol for cell-based quality control. The aim of this present work was therefore to develop a quick and reliable method that demonstrates the cellular response after ECP treatment. T-cell activation markers such as CD71, CD69, CD25, and Ki-67 were systematically analysed by flow cytometry for kinetics and reliability, and various T-cell stimulants and cell culture conditions were examined. The results were compared to the gold standard of CFSE-T-cell proliferation measurement and apoptosis measurement using Sytox and Annexin-V staining. Samples were taken from 11 healthy blood donors and 10 ECP procedures from 6 patients. In preliminary experiments on PBMCs of healthy blood donors, the surface marker CD71 proved to be suitable to indicate the effect of photopheresis in form of proliferation inhibition rapidly and reliably after UVA/8-MOP treatment. In the following validation experiments, CD71 expression after CD3/CD28/IL-2 T cell stimulation was effectively suppressed 16 hours after UVA/8-MOP treatment. The results could be confirmed by CFSE staining and measurement. In patient samples, both proliferative based assays were less sensitive and time consuming, whereas apoptosis measurement clearly showed an effect of UVA/8-MOP treatment in all samples. In summary, analysis of CD71 expression provides a novel and simple quality control to detect the inhibition of ECP-mediated T cell proliferation in healthy blood donor samples. In everyday clinical practice, this method could be conceivable in the quality control of ECP-related materials and substances. In patient samples, the measurement of apoptosis appears to be more reliable for verification of ECP procedures.