Studien zur Interaktion des Rinderkokzids Eimeria bovis mit seiner Wirtszelle

Abstract

Voraussetzung für hier durchgeführte Untersuchungen, war die Etablierung einer in vitro-Kultur für E. bovis. Die erarbeiteten Kulturen unter Einbeziehung von primären bovinen Endothelzellen (BUVEC, BAEC, BSLEC) sowie bovinen Epithelzellen aus dem Darm (BFGC, BCEC) liessen sich dosiert infizieren und erlaubten die Entwicklung des Parasitens bis zum Abschluss der ersten Merogonie unter Bildung von reifen Makromeronten. Beobachtungen zu sich ablösenden, unreife Meronten lassen auf eine mögliche Verbreitungsstrategie des Parasitens schließen. Die Entwicklung zum Makromeronten entspricht etwa der, die in vivo zu beobachten ist. Die immense Vergrößerung der Wirtszelle (> 250 müm) wird dabei offensichtlich von einer parasiten-induzierten Umgestaltung des Wirtszellzytoskeletts (u. a. Aktinfilamente und Mikrotubuli) getragen. In BFGC-Kulturen konnte zudem gelegentlich die vollständige Entwicklung der Parasiten bis zur Produktion von Oozysten beobachtet werden. In BCEC-Kulturen fand die zweite Merogonie statt. Auf der Oberfläche von Makromeronten-tragenden Wirtszellen wurden erstmalig merozoitenspezifische, immunreaktive Komponenten ab dem Tag 7 p. i. nachgewiesen. Obwohl ihre Rolle bisher noch völlig unklar ist, lassen unsere Daten vermuten, dass diese stadienspezifischen Komponenten aus Mikronemen und Dichte Granula stammen und noch unbekannte Funktionen bei der Entwicklung einer protektiven Immunantwort haben könnten.E. bovis-Sporozoiten besiedeln mit Endothelzellen hochreaktive Wirtszellen, die ein breites Spektrum an pro-inflammatorischen und immunmodulatorischen Molekülen synthetisieren können. Eine erfolgreiche Entwicklung unter diesen Bedingungen setzt hochangepasste Invasions- und Evasionsstrategien von E. bovis voraus. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass E. bovis-Sporozoiten, anders als Merozoitenstadien, über einen alternativen Invasionsmechanismus verfügen, der es ihnen ermöglicht, ohne Ausbildung einer PV durch Zellen zu migrieren. Theoretisch könnte diese Art der Zellinvasion freien E. bovis- Sporozoiten auf ihrer komplexen Wanderung von der mukosalen Oberfläche zu den tiefergelegenen Lymphendothelzellen dienen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass E. bovis-Sporozoiten sowie T. gondii- und N. caninum-Tachyzoiten bis zu 24 h p. i. nach der Zugabe von Kalzium-Ionophor A23187 zum Egress aus der Wirtszelle stimuliert werden können. Jedoch ergaben sich parasitenspezifische Unterschiede in der Freisetzung der Merozoiten aus reifen Meronten nach der Applikation dieses Ionophores. Der Egress aller drei hier verwendeten Kokzidienarten ließ sich nicht durch die Zugabe von Protease-Inhibitor E64 hemmen, wie zuvor bei Plasmodium beschrieben. Die stadienspezifische Fähigkeit zum Egress spielt vermutlich eine wichtige Rolle bei der erfolgreichen Besiedlung von Wirtszellen. Inbesondere scheinen früh eingedrungene Parasiten diese Möglichkeit zu nutzen, um einem adversen intrazellulären Mileu zu entkommen.Die Reaktionen infizierter Endothelzellen als Wirtszelle selbst können unter den Komplex der nicht-adaptativen Immunreaktionen eingestuft werden. In der Zusammenfassung zeigen alle bisherigen Studien am Endothel, dass E. bovis in der frühen Phase der Entwicklung zum Makromeronten im Vergleich mit den rasch proliferierenden Arten T. gondii und N. caninum in einem geringeren Maß befallene Endothelzellen aktiviert, wenn nicht sogar hemmend auf diese Wirtszelle einwirkt. Das Ausmaß der Expression sowohl von Adhäsionsmolekülen (E- und P-Selektin, ICAM-1, VCAM-1) als auch der resultierenden Adhäsion von PMN blieb im Vergleich zu T. gondii und N. caninum schwächer, was insgesamt als Teil einer möglichen Evasionsstrategie gedeutet werden kann. Es ließ sich zudem zeigen, dass E. bovis sowohl die Transkription der entsprechenden Gene als auch die PMN-Adhäsion nach Stimulation mit TNF-alpha negativ beeinflussen kann. Eine Modulation der MHC-Expression im Verlauf der ersten Merogonie in infizierten Endothelzellen, scheint bei dagegen E. bovis im Gegensatz zu anderen Apicomplexa keine Rolle zu spielen. Die Beobachtungen insgesamt deuten darauf hin, dass in E. bovis-infizierten Endothelzellen alle Reaktionen unterbleiben oder allenfalls auf niedrigem Niveau ablaufen, über die das nicht-adaptative Immunsystem aktiviert werden könnte. Damit und in Verbindung mit der hier nachgewiesenen Beeinträchtigung der Apoptosefähigkeit E. bovis-infizierter Zellen über die Induktion anti-apoptotischer Proteine (c-IAP1, c-FLIP) scheinen offensichtlich Voraussetzungen dafür gegeben zu sein, dass sich der Parasit in einem langwierigen Prozess zum Makromeronten entwickeln kann. A prerequisite for the cell- and immunobiological studies concerning parasite invasion and immunoreactions against E. bovis was the establishment of an in vitro culture system. Such in vitro-systems based on primary bovine endothelial cells (BUVEC, BAEC, BSLEC) as well as bovine epithelial cells of the intestine (BFGC, BCEC) were succesfully established. Parasite infections could be performed in a dose-dependent manner and the cells allowed the development of mature first generation macromeronts. Observations based on the release of inmature meronts from cell monolayers might be interpreted as a dissemination strategy of the parasite. The development of macromeront formation corresponded to the one seen in vivo. The enormous enlargement suffered by the infected host cell (> 250 mym) was combined with a rearrangment and significant increase of host cell cytoskeletal elements (amongst others actin filaments and microtubules). Occasionally, in infected BFGC cultures the complete development of E. bovis was achieved resulting in oocysts formation. In BCEC cultures, the second merogony was successfully completed. For the first time merozoite-specific and immnunoreactive components were demonstrated at 7 days p. i. on the surface of host cells carrying macromeronts. Although the role of parasite-specific suface antigens of E. bovis-infected cells described here are yet completely unknown, the results of this study suggest new functions in the development of protective immunity of these highly stage-specific parasite molecules derived from micronemes and dense granules.Sporozoites of E. bovis must invade highly reactive endothelial host cells, which are able to produce a wide spectrum of pro-inflammatory and immunomodulatory molecules. A successful parasitic development under such conditions implicate highly adapted invasion and evasion strategies of E. bovis. In this context, it was shown that sporozoites of E. bovis, but not merozoites, are able to infect host cells by an alternative mechanism of invasion without forming a PV and thereby traversing through cells. In theory, this alternative mode of invasion might reflect the complex mechanism used by free sporozoites within the gut when migrating from the mucosal surface to the deeper lying lymphatic endothelial host cells.Furthermore, it was demonstrated that the egress of intracellular sporozoites of E. bovis as well as tachyzoites of T. gondii and N. caninum can actively be induced until 24 h p. i. by the use of the calcium ionophore A23187. However, parasite-specific differences were observed regarding the exit of merozoites from mature meronts after the application of the ionophore. The egress of all three coccidian species used in these experiments was not affected by the protease inhibitor E64, as previously described for Plasmodium. The stage-specific egress capacity of the parasites could be judged as an important mechanism to establish successful infection of host cells. In particular, the recently invaded parasites seem to make use of this mechanism to escape from an adverse intracellular environment. Reactions of infected endothelial cells themselves can be judged as innate immune responses. In this context, all studies performed so far in the endothelial system indicate that E. bovis induce much weaker reactions of host endothelial cells than T. gondii and N. caninum infections do, which have direct implications in the outcome of innate immune reactions. The extent of expression of adhesion molecules (E- and P-selectin, ICAM-1, VCAM-1), as well as the resulting PMN adhesion, was always lower in E. bovis when compared to T. gondii and N. caninum, which may be interpreted as a sort of evasion strategy. In the case of E. bovis, the effects of TNF-alpha stimulation on adhesion molecule gene transcription and PMN adhesion was efficiently reduced by this parasite. The modulation of MHC expression, which has been described as an important evasion strategy for other apicomplexan parasites, was not observed during the course of E. bovis first merogony in infected endothelial cells, meaning that this strategy might not play a role. Overall these observations indicate, that E. bovis-infected endothelial cells do not respond or at the most occurring at low levels. Additionally the capacity of E. bovis to inhibit the apoptosis of host cells by the expression of anti-apoptotic proteins (cIAP1, c-FLIP) apparently seem preconditions for the parasite to assess the enduring devepoment into macromeronts.